正常及早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的蛋白組學(xué)初步研究.pdf

1、糖尿病及其并發(fā)癥的防治是關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的重大課題,糖尿病眼部并發(fā)癥占到糖尿病并發(fā)癥的20％～24％,其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)是最主要的致盲原因。長(zhǎng)久以來DR的血管病變機(jī)制一直是臨床防治及基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。然而近十年來DR的發(fā)病機(jī)制研究已逐漸轉(zhuǎn)向了對(duì)早期糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變?cè)虻奶接?。糖尿病作為一種多因素的全身性疾病,高糖代謝、超氧化物和糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)等代謝毒性物質(zhì)的積聚、缺血缺氧

2、、氧化應(yīng)激、炎癥及免疫反應(yīng)等等均可最終導(dǎo)致神經(jīng)組織凋亡、膠質(zhì)增生等病理改變。糖尿病發(fā)病伊始有哪些蛋白因子作為“扳機(jī)”觸發(fā)了這些病理改變呢?隨著病程的延長(zhǎng),又有哪些因子參與進(jìn)來呢?它們之間有哪些聯(lián)系呢?近年來迅速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,具有觀察由多基因事件引起的多蛋白質(zhì)組分整體變化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),更接近生命現(xiàn)象的本質(zhì),能動(dòng)態(tài)、整體、定量地考察疾病發(fā)生發(fā)展過程中全部蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化,對(duì)于探討疾病機(jī)理、尋找疾病診斷的特異標(biāo)志物和藥物治療的靶標(biāo)

3、來說,是一種有效的高通量的研究模式,可獲得一些傳統(tǒng)手段無法得到的新蛋白標(biāo)志物和關(guān)鍵分子,極大地豐富診斷標(biāo)志物的選擇組合,并有助于復(fù)雜致病機(jī)理的全面闡明,目前已被廣泛用于研究各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,并取得了很多重大的成就。
　　 本碩士研究生論文工作是復(fù)旦大學(xué)眼耳鼻喉科醫(yī)院玻璃體視網(wǎng)膜疾病課題組與復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)平臺(tái)的合作項(xiàng)目。本研究工作的主要貢獻(xiàn)為:采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,對(duì)成模早期(成模后1,2,4,6,8

4、周內(nèi))5組時(shí)點(diǎn)及正常大鼠的神經(jīng)視網(wǎng)膜進(jìn)行了蛋白組學(xué)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。研究初步建立了基本的正常大鼠視網(wǎng)膜的蛋白譜,以此作為研究早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜蛋白表達(dá)差異的基礎(chǔ)線,我們對(duì)各時(shí)點(diǎn)比較后得到差異蛋白,篩選早期糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)病變相關(guān)因子,同時(shí)按早期糖尿病病程建立時(shí)間梯度曲線,從而為進(jìn)一步縱向功能性研究打下基礎(chǔ)。為臨床糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期防治提供了新思路。
　　 本論文由四部分組成。第一章前言首先概述了早期糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制

5、的研究進(jìn)展,提出早期糖尿病視網(wǎng)膜即可出現(xiàn)神經(jīng)退行性變,其病變機(jī)制是由多因素、多通路控制的,故而需要引入蛋白組學(xué)為研究開拓思路,提供新線索。然后概述了蛋白質(zhì)組學(xué)這一新興學(xué)科發(fā)展現(xiàn)狀和技術(shù)進(jìn)展,包括雙相凝膠電泳技術(shù),生物質(zhì)譜技術(shù),色譜分離技術(shù),蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。然后概述了蛋白組學(xué)在糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制研究中的應(yīng)用進(jìn)展,提出本課題工作的研究方向。
　　 第二章所述工作為論證蛋白組學(xué)研究視網(wǎng)膜樣本的可行性,以及選擇恰當(dāng)?shù)牡鞍捉M學(xué)研究方案

6、,先用正常大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜樣品進(jìn)行蛋白組學(xué)預(yù)試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中共從6只SD大鼠、12只眼的神經(jīng)視網(wǎng)膜中提取到了蛋白3 mg,進(jìn)行2-PADE電泳跑膠,考馬斯亮藍(lán)染色后得到了清晰的條帶和蛋白點(diǎn)。故提示大鼠視網(wǎng)膜的蛋白組研究對(duì)蛋白樣品量要求至少達(dá)到3mg以上,才能得到較清晰的結(jié)果。也就是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中要求每組樣品至少有6只以上大鼠的雙眼視網(wǎng)膜方可達(dá)到蛋白組分析的定量要求。為了提高研究的敏感性及特異性,最終決定采用蛋白組學(xué)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法(SCX

7、-RPLC-MSMS)作為研究方法。
　　 第三章所述工作用高劑量(65mg/kg)STZ成功建立了Ⅰ型糖尿病大鼠模型,共有43只大鼠成模,造模成功率為74.1％。大鼠模型表現(xiàn)出典型Ⅰ型糖尿病癥狀。5組糖尿病大鼠自成模后血糖濃度保持在16.7mmol/L以上,并且較穩(wěn)定。對(duì)照組血糖濃度無明顯波動(dòng),基本在5.88±0.01mmol/L左右。糖尿病大鼠體重隨著日齡的增加而減輕,對(duì)照組的體重隨著日齡的增加而增加。本實(shí)驗(yàn)所用的模型為糖尿

8、病模型造模成功后8周、6周、4周、2周及1周內(nèi)的大鼠,為目前公認(rèn)的早期糖尿病大鼠模型。
　　 第四章所述工作建立了正常大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜全蛋白質(zhì)表達(dá)譜并且以正常組為基線,對(duì)5組時(shí)點(diǎn)的早期糖尿病大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜進(jìn)行了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。共獲得207個(gè)差異蛋白的定性定量信息。這些差異蛋白中有11個(gè)僅存在于正常大鼠視網(wǎng)膜中,其余為正常及早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜所重疊共有,并且隨病程的發(fā)展其表達(dá)在各時(shí)點(diǎn)有所不同。其中又有177個(gè)從發(fā)病后一周及兩

9、周后就出現(xiàn)了顯著的表達(dá)變化,并且隨病程的發(fā)展呈現(xiàn)不同的變化曲線。這些差異蛋白涉及多種蛋白功能,如細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)元功能、視覺功能等等。由于蛋白數(shù)量龐大,蛋白的分類及功能論證工作尚未完成,故而無法對(duì)所有差異蛋白進(jìn)行全面闡述。本文僅著重探討了以下幾種具有重要意義的蛋白:高移動(dòng)族核小體結(jié)合域家族的Hmgn1、酪氨酸3單加氧酶(Ywhag14-3-3 protein)、神經(jīng)元蛋白激酶酪氨酸底物(Pacsin1,Pro