表沒食子兒茶素沒食子酸酯對福美雙誘導(dǎo)的肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良的影響.pdf

1、肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良(Tibial Dyschondroplasia，TD)是伴隨著肉雞過快生長而發(fā)生的一種骨骼性疾病，主要病理學(xué)特征是病雞脛骨近端干骺面生長板內(nèi)出現(xiàn)無血管化亦不能鈣化的白色軟骨栓。TD的發(fā)生一方面是由于肉雞脛骨軟骨生長板血管生成受阻，肥大區(qū)血管浸潤減少，無法帶來成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞以及細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分，導(dǎo)致鈣化區(qū)軟骨無法完成骨沉積過程，最終形成白色的軟骨栓。另一方面，TD的發(fā)生伴隨著大量軟骨細(xì)胞損傷，細(xì)胞

2、增殖、分化過程異常，蛋白分泌功能受到破壞，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解速率下降，無法為后期骨沉積準(zhǔn)備構(gòu)建出充足的空間結(jié)構(gòu)。綜合同行和本實(shí)驗(yàn)室研究成果，我們發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白家族(HSPs)成員Hsp-90在介導(dǎo)肉雞TD發(fā)生過程中起到非常關(guān)鍵的作用。在哺乳動物，Hsp-90被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)血管生成，加速骨骼發(fā)育。而在禽類，Hsp-90表達(dá)量的上升會抑制血管的生成，起到與哺乳動物相反的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，肉雞TD發(fā)生過程中脛骨生長板軟骨細(xì)胞H

3、sp-90表達(dá)量顯著增加，同時肥大區(qū)軟骨內(nèi)毛細(xì)血管生成減少，延伸受阻，軟骨細(xì)胞經(jīng)歷缺氧、蛋白分泌異常等癥狀。對TD肉雞注射Hsp-90特異性抑制劑17-DMAG能明顯減輕TD癥狀，脛骨血管生成增加，延伸得到恢復(fù)。Hsp-90對禽類血管生成的抑制可能與其對軟骨細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌調(diào)控有關(guān)，但調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶提取物中含量最高的一種多酚，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。另外，EGCG

4、還可以通過調(diào)控HSPs及其客戶蛋白表達(dá)，抑制腫瘤生長。作為一種重要的Hsp-90抑制劑，通過注射EGCG治療肉雞TD具有很好的科學(xué)依據(jù)和可行性，而目前還沒有任何關(guān)于EGCG對TD作用效果和機(jī)制的研究。
　　本研究查閱大量文獻(xiàn)，通過福美雙誘導(dǎo)方式建立肉雞TD模型，并在肉雞TD發(fā)生前和過程中分別給與EGCG干預(yù)，觀察EGCG對TD的預(yù)防和治療效果。試驗(yàn)檢測EGCG干預(yù)前后軟骨細(xì)胞Hsp-90基因、蛋白表達(dá)水平，探究EGCG對TD肉雞軟

5、骨細(xì)胞Hsp-90表達(dá)的調(diào)控效果。試驗(yàn)同時通過檢測軟骨細(xì)胞內(nèi)與血管生成關(guān)系密切的細(xì)胞因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體Flk-1基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步揭示EGCG通過調(diào)控Hsp-90表達(dá)影響軟骨血管生成的作用機(jī)制，為研究EGCG治療TD提供有力的依據(jù)。試驗(yàn)具體得到如下結(jié)論:
　　1.EGCG對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞生長性能及GP形態(tài)學(xué)影響
　　飼料中添加福美雙方式誘發(fā)的TD肉雞表現(xiàn)精神萎靡、食欲不佳、體重下降、站立困難、

6、行走能力喪失和骨骼發(fā)育畸形等。TD肉雞病理剖檢癥狀典型，與自然發(fā)生的TD癥狀相同。病雞GP縱切面可見一片白色透明、無血管亦不能鈣化的軟骨栓。EGCG預(yù)防組和EGCG治療組肉雞精神狀態(tài)良好，食欲增強(qiáng)，體重增加，具有一定的自由行走能力。縱切GP可見白色透明的軟骨栓明顯減小，說明EGCG對肉雞TD具有一定的預(yù)防和治療作用。
　　2.EGCG對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞軟骨組織病理學(xué)影響
　　縱向切割各組肉雞脛骨GP后做HE染色，相比對照

7、組，TD發(fā)生組肉雞脛骨GP增殖區(qū)軟骨細(xì)胞分化異常，血管生成減少、延伸受阻。EGCG預(yù)防組和EGCG治療組肉雞脛骨GP軟骨細(xì)胞分化正常，血管生成增加，并向軟骨細(xì)胞增殖區(qū)深處延伸。
　　3.EGCG對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞體內(nèi)相關(guān)酶活力的影響
　　試驗(yàn)對EGCG處理前后TD肉雞血清中堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)活力水平進(jìn)行檢測，這些指標(biāo)均能在一定程度上反映肝功能代謝情況。結(jié)果顯示，相

8、比于對照組肉雞，TD發(fā)生組肉雞中SOD、ALP活力顯著降低(P＜0.05)，AST水平明顯上升(P＜0.05)。相比于TD發(fā)生組肉雞，EGCG預(yù)防組和EGCG治療組肉雞中SOD、ALP活性均呈現(xiàn)不同程度的升高（P＜0.05），AST濃度也下降至正常值水平。以上結(jié)果說明EGCG對肉雞TD導(dǎo)致的肝功能損傷具有一定的改善作用。
　　4.EGCG對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞軟骨GP細(xì)胞中Hsp-90、VEGF、Flk-1基因表達(dá)水平的影響

9、>　　試驗(yàn)對EGCG處理前后TD肉雞脛骨GP細(xì)胞中Hsp-90、VEGF、Flk-1基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，以分析EGCG對TD肉雞血管生成能力改變的作用機(jī)制。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，TD發(fā)生組肉雞GP軟骨細(xì)胞Hsp-90、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上升，分別達(dá)到對照組水平的5.5倍(P＜0.05)和8倍（P＜0.05）。相對于TD發(fā)生組，EGCG預(yù)防組和EGCG治療組肉雞GP軟骨細(xì)胞Hsp-90、VEGF基因表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降，甚至低

10、于對照組水平。相對于對照組，TD發(fā)生組肉雞Flk-1基因表達(dá)量出現(xiàn)一定程度的下降;給予EGCG后，F(xiàn)lk-1基因表達(dá)水平得到明顯恢復(fù)。說明EGCG可以通過影響與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子調(diào)控TD肉雞軟骨細(xì)胞生成和浸潤。
　　5.EGCG對肉雞脛骨軟骨生長板細(xì)胞中Hsp-90蛋白表達(dá)量的影響
　　試驗(yàn)對EGCG處理前后TD肉雞脛骨GP細(xì)胞中Hsp-90蛋白進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，TD發(fā)生組肉雞GP軟骨細(xì)胞Hsp-90蛋白表達(dá)量