倍硫磷和速滅威半抗原分子設(shè)計(jì)及其免疫效果研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥倍硫磷由硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)(x)和芳香環(huán)結(jié)構(gòu)(Y)兩部分構(gòu)成，從倍硫磷分子上5個(gè)不同位置各自引出連接手臂結(jié)構(gòu)(Arm)，設(shè)計(jì)了5種形式的半抗原：X-Arm-Y(手臂結(jié)構(gòu)位于近似整個(gè)分子中間的位置)、Arm-X-Y、X-Y-Arm、X-Arm和Arm-Y；合成了5種相應(yīng)的倍硫磷半抗原，即4-[2-(二甲氧基硫代磷酰氧基)-4-甲基-5(甲硫基)苯胺基]-4-羰基丁酸(Hapten A)、6-{甲氧基[4-(甲硫基)苯氧基]硫代磷酰胺

2、基}己酸(Hapten B)、4-[4-(二甲氧基硫代磷酰氧基)-2-甲基苯基胺基]-4-羰基丁酸(HaptenC)、4-[3-甲級(jí)-4-(甲硫基)苯氧基]丁酸(王lapten D)和4-(二甲氧基硫代磷酰胺基)丁酸(Hapten E)；質(zhì)譜和核磁共振譜鑒定了這5種半抗原結(jié)構(gòu)。 合成的倍硫磷5個(gè)半抗原中，Hapten A試圖在人工抗原上平等地暴露倍硫磷的兩個(gè)結(jié)構(gòu)特征，即硫代磷酸酯基團(tuán)X和苯環(huán)基團(tuán)Y，Hapten B偏向于暴露X，

3、Hapten C偏向于暴露Y，Hapten D只暴露Y，Hapten E只暴露X。利用活潑酯方法將Hapten A-C與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，將Hapten A-E與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)。利用3個(gè)BSA偶聯(lián)物共制備了6個(gè)鼠多克隆抗體，共測(cè)定了30個(gè)抗體/包被抗原組合對(duì)倍硫磷分析的靈敏度和特異性，篩選出一個(gè)最佳組合，該組合具有高度的靈敏度(I<,50>為0.08ng/mL)和特異性。結(jié)果表明，當(dāng)目標(biāo)分析物與免疫半抗原的結(jié)構(gòu)差異性小

4、于包被半抗原與免疫半抗原的結(jié)構(gòu)差異性的時(shí)候，具有高靈敏度的異源ELISA方法就很有可能被建立。免疫結(jié)果表明，采用不同空間手臂連接位點(diǎn)的免疫半抗原有可能顯著地提高抗體的質(zhì)量，即靈敏度和/或特異性。結(jié)果還表明，半抗原連接位點(diǎn)附近取代基的變化對(duì)半抗原與抗體結(jié)合的削弱作用比遠(yuǎn)離半抗原結(jié)合位點(diǎn)基團(tuán)的變化的削弱作用更大。 根據(jù)以上倍硫磷免疫與包被半抗原組合分析結(jié)果，選擇利用活潑酯法將人工合成的2種倍硫磷半抗原4-[4-(二甲氧基硫代磷酰氧基

5、)．2．甲基苯基胺基]-4-羰基丁酸(Hapten C)和6-{甲氧基[4-(甲硫基)苯氧基]硫代磷酰胺基)己酸(Hapten B)分別與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共價(jià)偶聯(lián)，以Hapten C-BSA為免疫原制備倍硫磷兔多克隆抗體，以Hapten B-OVA為包被抗原測(cè)定所得抗血清效價(jià)(抗血清呈現(xiàn)陽(yáng)性的最大稀釋倍數(shù))都在64000倍以上，而且抗體僅與殺螟硫磷有4.5％的交叉反應(yīng)，而與其他農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率都在0.1％以下；

6、通過分析條件優(yōu)化，確定了倍硫磷酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作條件，建立了定量測(cè)定倍硫磷的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，I<,50>為0.0107 ng/mL，檢測(cè)限為0.0002 ng/mL。葡萄和桃的果實(shí)及水中的平均添加回收率在81.9-104.0％之間。本研究為倍硫磷農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中殘留量快速檢測(cè)新增一種有效的方法。針對(duì)氨基甲酸酯農(nóng)藥速滅威設(shè)計(jì)了五種結(jié)構(gòu)半抗原。以3-甲基苯酚、雙光氣和3-氨基丙酸為主要原料合成了Hapten

7、 1，即3-(3-甲苯基氧基羰基氨基)丙酸；以苯酚、雙光氣和6-氨基己酸為主要原料合成了Hapten 2，即6-(苯氧基羰基氨基)己酸；以2-異丙氧基苯酚、雙光氣和4-氨基丁酸為主要原料合成了Hapten 3，即4-((2-異丙氧基苯氧基)羰基氨基)丁酸；以3-甲基苯酚和4-溴丁酸乙酯為主要原料合成了Hapten 4，即4-(3-甲苯基氧基)丁酸；并把3-(3-羥基)苯丙酸設(shè)計(jì)為Hapten 5；質(zhì)譜和(或)核磁共振譜鑒定了這些半抗原結(jié)

8、構(gòu)。 利用活潑酯法將速滅威的以上5種半抗原(Hapten 1-5)與載體牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)共價(jià)偶聯(lián)制備成速滅威抗原，其中BSA-Hapten 1用來制備速滅威兔多克隆抗體MpAb01和MpAb02，而OVA-Hapten 1-5用作包被抗原，共測(cè)定并比較了10個(gè)抗原/抗體組合的相對(duì)親和性、6個(gè)組合的靈敏度和3個(gè)組合的特異性。數(shù)據(jù)顯示，MpAb01/OVA-Hapten 4組合的靈敏度最高(I<,50>=0

9、.11μg/mL)且特異性最強(qiáng)(與混滅威等7種農(nóng)藥的CR值均為0)，但親和性相對(duì)偏弱；Hapten 2和Hapten 1作為包被半抗原的親和性及靈敏度相差不大，但Hapten 2的異源組合對(duì)混滅威、殘殺威等6種農(nóng)藥都有不同程度交叉反應(yīng)，而Hapten 1的同源ELISA組合只對(duì)混滅威有交叉反應(yīng)(30％)。結(jié)合半抗原和分析物化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明：(1)在保證一定滴度值前提下，包被半抗原與免疫半抗原結(jié)構(gòu)相差越遠(yuǎn)(尤其是半抗原空間手臂連接位

10、點(diǎn)差異)可能越有利于建立較高靈敏度的ELISA；(2)免疫半抗原連接位點(diǎn)處及附近的基團(tuán)在抗體-半抗原互作中可能起非常重要的作用。 根據(jù)以上速滅威免疫與包被半抗原組合分析結(jié)果，選擇抗原抗體組合MpAb01/OVA-Hapten 1進(jìn)行進(jìn)一步研究。測(cè)定了離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑、pH值、封閉物等影響因子對(duì)免疫分析的影響，確定了速滅威酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作參數(shù)，并建立了定量測(cè)定速滅威的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，檢測(cè)線性范圍為

11、1～10000ng/mL，I<,50>為40.738ng/mL，檢測(cè)限為0.014～0.018ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)4.0％，批間變異系數(shù)11.4％，土壤、稻谷和水中的添加回收率依次為80％、93％和107％。所建立的ELISA分析方法靈敏實(shí)用，為速滅威在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中殘留量快速檢測(cè)新增一種有效的方法。 提出了半抗原．抗體互作模型，內(nèi)容包括：(1)免疫半抗原結(jié)構(gòu)(尤其指空間手臂連接位點(diǎn)不同的半抗原結(jié)構(gòu))與抗體反應(yīng)特性之間是一一

12、對(duì)應(yīng)關(guān)系，特定空間手臂連接位點(diǎn)的半抗原與其相應(yīng)抗體結(jié)合后的復(fù)合物就有一個(gè)特定的最穩(wěn)定空間結(jié)合形式；(2)在半抗原．抗體的最穩(wěn)定空間結(jié)合形式中，免疫半抗原空間手臂連接位點(diǎn)左右的基團(tuán)靠近相應(yīng)抗體的“活性中心”，并與之相互吻合； (3)與免疫半抗原結(jié)構(gòu)相比，差異基團(tuán)遠(yuǎn)離免疫半抗原空間手臂連接位點(diǎn)的類似物與抗體的結(jié)合能力較強(qiáng)，而差異基團(tuán)靠近免疫半抗原空間手臂連接位點(diǎn)的類似物與抗體的結(jié)合能力較弱或根本就沒有結(jié)合能力。利用倍硫磷抗體和速滅威抗體與反