敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A對非特異性免疫聯(lián)合毒作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的: 1.了解敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)暴露及聯(lián)合暴露對小鼠巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞毒件。 2.探討敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)暴露及聯(lián)合暴露對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。 3.了解敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)暴露及聯(lián)合暴露對NK細(xì)胞免疫功能的影響。 材料與方法: 1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞和小鼠脾淋巴細(xì)胞毒作用1.1受試物和細(xì)胞的選擇開展敵匹硫磷、殘殺威和雙

2、酚A進(jìn)行體外非特異性免疫細(xì)胞毒性研究。采用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW364.7細(xì)胞和小鼠脾淋巴細(xì)胞作為受試細(xì)胞。 1.2敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)及聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞毒作用采用1h、4h、12h、24h、48h、72h作為受試物單獨(dú)暴露對RAW264.7細(xì)胞的染毒時(shí)間，而選用1h、2h、4h、8h、16h、24h作為受試物單獨(dú)暴露對脾淋巴細(xì)胞的染毒時(shí)間，每時(shí)間點(diǎn)均設(shè)計(jì)同一劑量系列。通過MTT法檢測細(xì)胞毒性。觀

3、察敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)暴露對RAW264.7細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞活性的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，確定適宜的染毒時(shí)間。觀察既定染毒時(shí)間內(nèi)受試物單獨(dú)暴露的劑量效應(yīng)關(guān)系，用概率單位法計(jì)算受試物的半數(shù)抑制濃度(IC50)及其95％置信區(qū)間(CI)。依據(jù)單獨(dú)暴露的IC50，將敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A按等毒性比混合，了解聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞活性的劑量效應(yīng)關(guān)系，求得聯(lián)合暴露的IC50。 1.3敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對R

4、AW264.7細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞毒性聯(lián)合作用評價(jià)根據(jù)敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)暴露及聯(lián)合暴露IC50，采用相加系數(shù)法，評價(jià)敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A對RAW264.7細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞毒性的聯(lián)合作用方式。 2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞和小鼠脾NK細(xì)胞功能的影響受試物和細(xì)胞的選擇同第1章。 2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)暴露和聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞吞噬功能影響的劑量效應(yīng)關(guān)系采

5、用巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球流式細(xì)胞術(shù)，確定敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)暴露對RAW264.7細(xì)胞吞噬功能影響的劑量效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)單獨(dú)暴露IC50，將敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A按等毒性比混合，確定混合物的劑量效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)單獨(dú)暴露與聯(lián)合暴露的劑量效應(yīng)關(guān)系，選擇適宜劑量進(jìn)行2×2析因分析實(shí)驗(yàn)，確定敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A的聯(lián)合作用方式。 2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)暴露和聯(lián)合暴露對脾NK細(xì)胞免疫功能影響的劑量效應(yīng)關(guān)系

6、采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，研究敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨(dú)暴露對小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的劑量效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)單獨(dú)暴露IC50，將敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A按等毒性比混合，確定受試物聯(lián)合暴露的劑量效應(yīng)關(guān)系。與此同時(shí)，對雌雄小鼠來源的脾NK細(xì)胞殺傷活性進(jìn)行比較，以觀察受試物在體外條件下對NK細(xì)胞殺傷活性是否存在性別差異。 根據(jù)單獨(dú)暴露與聯(lián)合暴露的劑量效應(yīng)關(guān)系，選擇適宜劑量進(jìn)行2×2析因分析實(shí)驗(yàn)，以特異性殺傷活性和反映脾活化N

7、K細(xì)胞比例的表面抗原CD69+/NKG2D+表達(dá)水平作為檢測終點(diǎn)，綜合判定敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A的聯(lián)合作用方式。 結(jié)果: 1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)暴露和聯(lián)合暴露對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞和小鼠脾淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用1.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)及聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞毒作用1.1.1時(shí)間效應(yīng)關(guān)系敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加以及染毒時(shí)

8、間的延長而改變，且染毒劑量與染毒時(shí)間之間存在明顯的交互作用。根據(jù)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系研究結(jié)果，確定染毒時(shí)間為24h。 1.1.2劑量效應(yīng)關(guān)系1.1.2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)暴露對RAW264.7細(xì)胞毒作用的劑量效應(yīng)關(guān)系染毒24h，敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A對RAW264.7細(xì)胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷163.9mg/L(125.6mg/L～302.9mg/L)，殘殺威425.2mg/L(329.9mg/L～606

9、.4mg/L)，雙酚A34.3mg/L(30.8mg/L～38.8mg/L)。 1.1.2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞毒作用的劑量效應(yīng)關(guān)系根據(jù)單獨(dú)暴露的IC50，將敵匹硫磷和雙酚A、殘殺威和雙酚A按等毒性比混合，敵匹硫磷與雙酚A混合物、殘殺威與雙酚A混合物對RAW264.7細(xì)胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷與雙酚A混合物157.3mg/L(143.7mg/L～175.8mg/L)，殘殺威與

10、雙酚A混合物258.4mg/L(238.5mg/L～281.2mg/L)。 1.1.3敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對RAW264.7細(xì)胞毒作用的聯(lián)合作用評價(jià)根據(jù)相加系數(shù)法的計(jì)算公式及判定標(biāo)準(zhǔn)，敵匹硫磷與雙酚A聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞毒性主要表現(xiàn)為拮抗作用，殘殺威與雙酚A聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞聯(lián)合毒性主要表現(xiàn)為相加作用。 1.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)及聯(lián)合暴露對小鼠脾淋巴細(xì)胞毒作用1.2.1時(shí)間效應(yīng)關(guān)系受試

11、物對小鼠脾淋巴細(xì)胞存活率的影響表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加以及染毒時(shí)間的延長而改變，且染毒劑量與染毒時(shí)間之間存在明顯的交互作用。根據(jù)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系研究結(jié)果，確定1h為染毒時(shí)間。 1.2.2劑量效應(yīng)關(guān)系1.2.2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)暴露對脾淋巴細(xì)胞毒作用的劑量效應(yīng)關(guān)系染毒1h，敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A受試物單獨(dú)暴露對小鼠脾淋巴細(xì)胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷81.9mg/L(63.4mg/L～113.8mg/L)

12、，殘殺威2727.8mg/L(2512.7mg/L～2978.9mg/L)，雙酚A147.4mg/L(104.4mg/L～226.0mg/L)。 1.2.2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A聯(lián)合暴露對脾淋巴細(xì)胞毒作用的劑量效應(yīng)關(guān)系根據(jù)單獨(dú)暴露的IC50，將敵匹硫磷和雙酚A、殘殺威和雙酚A按等毒性比進(jìn)行混合，敵匹硫磷與雙酚A混合物、殘殺威與雙酚A混合物對RAW264.7細(xì)胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷與雙酚A混合物109.6

13、mg/L(85.4mg/L～141.6mg/L)，殘殺威與雙酚A混合物1070.1mg/L(929.1mg/L～1244.2mg/L)。 1.23敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對脾淋巴細(xì)胞毒作用的聯(lián)合作用評價(jià)根據(jù)相加系數(shù)法的計(jì)算公式及判定標(biāo)準(zhǔn)，敵匹硫磷與雙酚A聯(lián)合暴露對小鼠脾淋巴細(xì)胞毒性表現(xiàn)為相加作用，殘殺威與雙酚A聯(lián)合暴露對小鼠脾淋巴細(xì)胞聯(lián)合毒性主要表現(xiàn)為相加作用。 2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)暴露和聯(lián)合暴露對RAW264

14、.7細(xì)胞和小鼠脾NK細(xì)胞免疫功能的影響2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)及聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響2.1.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)及聯(lián)合暴露對RAW264.7細(xì)胞功能影響的劑量效應(yīng)關(guān)系雙酚A(1.1×10-4mg/L～18mg/L)能增強(qiáng)RAW264.7吞噬熒光微球的能力，而敵匹硫磷(38.6mg/L～80.0mg/L)與殘殺威(35.6mg/L～120.0mg/L)則抑制RAW264.7的吞噬功能。

15、根據(jù)單獨(dú)暴露的IC50，將敵匹硫磷和雙酚A、殘殺威和雙酚A按等毒性比進(jìn)行混合。敵匹硫磷和雙酚A混合物(62.5mg/L～90.0mg/L)、殘殺威和雙酚A混合物(25.7mg/L和130.0mg/L)對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力均主要表現(xiàn)為抑制作用。 2.1.2敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對RAW264.7細(xì)胞吞噬功能影響的聯(lián)合作用評價(jià)60.0mg/L敵匹硫磷和12.0mg/L雙酚A、48.0mg/L殘殺威和4.0mg/L雙酚A對

16、PP和PI的影響均存在交互作用，且均為拮抗作用。 2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)及聯(lián)合暴露對脾NK細(xì)胞免疫功能的影響2.2.1適宜效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比例(簡稱效靶比，E/T)的確定固定靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)的密度為1×105個(gè)/ml，依次改變小鼠脾淋巴細(xì)胞密度，獲得不同E/T值。同時(shí)接種相應(yīng)不同密度的脾淋巴細(xì)胞，除了不加入YAC-1細(xì)胞外，其余同前。結(jié)果表明，100是最適宜本研究的E/T值。不同性別來源的NK細(xì)胞特異性殺傷活性

17、差異無顯著性(P<0.05)。 結(jié)論: 1.敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)與聯(lián)合暴露對巨噬細(xì)胞的毒作用大小順序?yàn)椋弘p酚A>敵匹硫磷>殘殺威，敵匹硫磷與雙酚A混合物>殘殺威與雙酚A混合物；敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨(dú)與聯(lián)合暴露對脾淋巴細(xì)胞的毒性大小順序?yàn)椋簲称チ蛄?雙酚A>殘殺威，敵匹硫磷與雙酚A混合物>殘殺威與雙酚A混合。 2.在單獨(dú)暴露條件下，敵匹硫磷和殘殺威能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能和NK細(xì)胞的殺傷活性；雙酚A則