芒果苷糖酯衍生物的非水相酶促合成及其抗炎活性研究.pdf

1、1、目的與意義：
　　芒果苷（Mangiferin，MGF）是一種具有Xanthone結(jié)構(gòu)的葡萄糖C-糖苷（分子式為C19H18O11，分子量為422.34），存在于漆樹科植物芒果(Mangifera indica L.)的果實、葉、樹皮，百合科植物知母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)的根莖、地上部分，鳶尾科植物射干（Belamcandachinensis(L.)DC.）的花、葉等植物中。
　　

2、MGF分子具有較大的平面結(jié)構(gòu)，溶解度較差（在純水及pH1.3～7.4的緩沖溶液中平均溶解度＜1mg·mL-1），而經(jīng)換算人的口服有效劑量為630mg，溶解單劑量MGF需要的胃腸道的液體體積＞250mL，根據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(Biopharmaceutics classification system，BCS)的定義MGF屬于一種溶解性差的藥物。此外，MGF在正丁醇-水系統(tǒng)中分配系數(shù)(Oil/waterpartition coeffic

3、ient，P)非常小(pH1～4時，P值約為2.3，當(dāng)pH值大于6.86時，P值僅為0.01)，通常P值與胃腸通透性相關(guān)性較好，P值在100～1000時，被動吸收較好，推測MGF胃腸通透性較差。再者，MGF在小鼠體內(nèi)腸道吸收效果較差，證實了MGF通透性差。綜合MGF上述三方面的性質(zhì)，MGF的低油水分配系數(shù)可能與其在小鼠體內(nèi)低生物利用度直接相關(guān)，按照生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)原則，MGF可歸類為BCS第4類藥物（低溶解性-低通透性），此

4、類藥物一般存在嚴(yán)重的生物利用度問題。
　　MGF具有豐富的藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用、抗糖尿病作用等。因此，課題組擬將MGF開發(fā)成為一種具有抗炎作用的新藥，但研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)MGF存在嚴(yán)重的吸收問題。MGF在人體中的抗炎劑量為630mg/次，一日3次，作為一個純度在90％以上的單體化合物，服用劑量顯然很大。將MGF開發(fā)成新藥，必須解決MGF低吸收的問題，如果提高了MGF吸收的生物利用度，藥效提高，最終能調(diào)整MG

5、F的給藥量。目前，課題組已經(jīng)開展提高M(jìn)GF溶解性的研究（應(yīng)用的技術(shù)包括成鹽、磺酸鹽、金屬離子螯合物、制劑手段提高溶解度等），而在提高M(jìn)GF通透性方面的研究尚屬空白。
　　將低脂溶性藥物制備成酯類化合物或前藥，從而提高藥物的油水分配系數(shù)，是提高該類藥物胃腸通透性（即被動吸收）的最常用的前藥設(shè)計策略。MGF具有黃酮類結(jié)構(gòu)，還有多個酚羥基及糖基上的多個羥基，可以對這些羥基進(jìn)行?；揎?，增加藥物分子整體脂溶性。采用化學(xué)法對黃酮類化合物進(jìn)行

6、?；?，空間選擇性不高，并且將活性酚羥基?；?，導(dǎo)致抗氧化活性降低。本文利用脂肪酶的酯化反應(yīng)或酯交換作用，可選擇性將化合物酯化修飾，不但提高黃酮類化合物的脂溶性，還能提高其穩(wěn)定性及抗氧化活性。
　　脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，即三?；视王ニ饷?，該酶催化天然底物油脂的水解，生成的產(chǎn)物包括脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶被廣泛用于酯、硫羥酸酯、酰胺類化合物、多元醇酯、多元酸酯三酰甘油酯及一些疏水性酯類的水解、醇解、

7、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)。在非水有機(jī)溶劑中，脂肪酶Novozym435對葡萄糖基6位羥基專屬性很高，可以催化葡萄糖的單?；?br>　　為此，本論文針對MGF低油水分配系數(shù)，從提高M(jìn)GF通透性角度出發(fā)，采用酶法合成MGF酯類前藥，嘗試解決MGF生物利用度問題，達(dá)到提高藥效的目的。理論上，還可為BCS4類藥物的研發(fā)提供思路。
　　2、方法和結(jié)果：
　　全文對MGF進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成酯類前藥，并對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及相關(guān)理化性質(zhì)進(jìn)

8、行測定，最后測定該前藥的抗炎活性。方法與結(jié)果如下:
　　(1)該部分對MGF溶解度及油水分配系數(shù)進(jìn)行研究。采用HPLC法測定MGF在pH為1.32，2.52，3.32，4.50，5.00，6.86，7.40，8.01緩沖溶液中的平衡溶解度。結(jié)果顯示MGF的溶解度隨pH提高而增加。在pH1.3～5.0的溶解度約為0.16 mg.mL-1;在pH6.86～7.4時溶解度增加至0.82mg.mL-1;當(dāng)pH8.01時溶解度為1.44 m

9、g·mL-1。
　　采用搖瓶-HPLC法測定MGF在正辛醇-緩沖溶液(pH1.32，2.52，3.32，4.50，5.00，6.86，7.40，8.01)體系中的表觀油水分配系數(shù)(P)。MGF的油水分配系數(shù)隨pH增加而降低，P值從2.313降低至0.05。
　　根據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)，推測MGF屬于BCS4類藥物（低溶解度-低通透性藥物）。提示，可以通過合成MGF脂溶性前藥，提高脂溶性達(dá)到提高M(jìn)GF通透性的目的。<

10、br>　　(2)本部分對MGF糖酯衍生物的非水相酶促合成的可行性進(jìn)行研究。以MGF為酰基受體，以甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯為酰基供體，利用商品脂肪酶Novozym435為催化劑，在二氧六環(huán)中經(jīng)過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，合成了3種?；腗GF糖酯衍生物，經(jīng)HPLC-MS分析鑒定3種產(chǎn)物為甲?；鵐GF、乙酰基MGF、丙?；鵐GF。從HPLC圖譜及TLC圖譜分析，衍生物的脂溶性均明顯提高，達(dá)到目標(biāo)化合物預(yù)期目的。
　　(3)本部分對6'-O-丙酰

11、基芒果苷(PMGF)合成、分離、結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行研究，并對合成條件進(jìn)行優(yōu)化。首先，以MGF為酰基受體，丙酸乙酯為?；w，利用脂肪酶在有機(jī)溶劑中的酯交換作用，在MGF糖基6'-OH選擇性?；Ｆ浯?，采用制備液相色譜法分離得到高純度PMGF。然后，測定產(chǎn)物的MS譜、一維1H-NMR和13C-NMR確定分子量及分子結(jié)構(gòu)，并測定(g)-HMBC及(g)-HMQC對C、H進(jìn)行歸屬，確定酰化位置，最后確證產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為6'-O-丙?；⒐?。最后，優(yōu)化酶

12、促反應(yīng)條件，優(yōu)化后的酶促反應(yīng)條件為:在8 mL二氧六環(huán)中加入30 mg Novozym435、芒果苷30mg、丙酸乙酯1mL，在恒溫水浴振蕩搖床中60℃下反應(yīng)20h。
　　(4)對PMGF水溶解度、油水分配系數(shù)、體外水解穩(wěn)定性進(jìn)行考察，并與MGF做對比研究。首先，采用搖瓶法測定PMGF在純水(37℃)的溶解度，結(jié)果顯示PMGF溶解度為0.166±0.02μg·mL-1，與同條件下MGF的溶解度接近，PMGF并未由于脂溶性提高而導(dǎo)致

13、水溶解度下降。
　　其次，采用HPLC法測定PMGF在正辛醇-緩沖溶液中的油水分配系數(shù)，結(jié)果顯示PMGF在pH1.3～8.01范圍內(nèi)油水分配系數(shù)由21.104降低至0.108，比MGF均顯著增加4.33～92.36倍，其中在中性及堿性環(huán)境下提高倍數(shù)均在10倍以上，尤其在模擬腸液的pH(pH7.4)環(huán)境中增加了93.36倍，預(yù)測PMGF在腸道通透性將有很大程度提高。
　　然后，采用HPLC法測定PMGF在pH2及7.4溶液中的

14、水解穩(wěn)定性。PMGF在該溶液中均能緩慢水解為MGF。PMGF在pH2的酸性溶液中，按照一級速度過程水解為MGF，半衰期為69.3h;在pH7.4偏堿性溶液中，水解為MGF的比例及速度較慢，部分PMGF變成3種脂溶性高于MGF的未知產(chǎn)物（推測是丙?；D(zhuǎn)移到其他羥基后形成的產(chǎn)物，脂溶性仍然比MGF有所提高），導(dǎo)致PMGF濃度下降較快，半衰期為34.6h。
　　最后，PMGF濃度在血漿中按照非線性速度過程水解變成MGF，半衰期為11.7

15、～20.6h。
　　綜合上述內(nèi)容，與原型MGF相比較，PMGF在不降低溶解度前提下脂溶性顯著提高，在胃腸pH環(huán)境下能緩慢水解（水解半衰期＞30h）為MGF，主要在血漿中水解為原型MGF。推測將MGF修飾為PMGF能顯著提高M(jìn)GF的胃腸通透性，在吸收的時間段內(nèi)，PMGF比例較大，吸收入血后，能順利水解還原為MGF，提示，PMGF很有潛力作為MGF的前藥。
　　(5)本部分研究了人腸道菌群對MGF和PMGF的代謝作用。采用離體代

16、謝研究的方法，用富含人腸道菌群的培養(yǎng)液與MGF/PMGF在厭氧條件下共同孵育，采用大孔樹脂、制備液相色譜法分離代謝產(chǎn)物，經(jīng)HPLC-MS、一維1H-NMR和13C-NMR確證代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為MGF苷元(Norathyriol)。結(jié)果如下:PMGF在孵育開始0～2h內(nèi)全部水解為MGF，孵育第4～8h時間段PMGF和MGF逐步代謝為Norathyriol，第7h的Norathyriol濃度達(dá)到最高，隨后Norathyriol濃度持續(xù)下降，第1

17、2h仍然有明顯代謝產(chǎn)物。證實，PMGF轉(zhuǎn)化為MGF的主要部位是腸道，暴露在腸道菌群環(huán)境中僅需要2h就能將PMGF分解完全;MGF及PMGF在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化為Norathyriol，時滯4h。在腸道菌群作用下，PMGF完全水解需要2h，推測在此水解階段，未被水解的高脂溶性的PMGF持續(xù)吸收，凈效應(yīng)就是PMGF的吸收速度與程度會比原型MGF的要高。此外，代謝產(chǎn)物Norathyriol吸收的特征，有待進(jìn)一步研究。
　　(6)對比研究

18、了PMGF的體內(nèi)、體外抗炎活性。首先，利用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7在脂多糖刺激下產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，觀察PMGF和MGF對炎性細(xì)胞因子生成的影響，結(jié)果顯示低濃度（5μg·mL-1）MGF及PMGF體外對NO、IL-1、TNF-α無顯著抑制作用(抑制率＜7％)。其次，小鼠二甲苯致耳腫脹試驗表明，MGF和PMGF均顯示顯著的抗炎作用(抑制率＞30％，P＜0.05)，PMGF中、低劑量組的抗炎效果高于MGF中、低劑量組但無顯著性差異(P＞

19、0.05)，提示，PMGF中、低劑量組藥效具有高于同劑量的MGF的趨勢，出現(xiàn)以上現(xiàn)象，可能由于提高M(jìn)GF脂溶性改善膜通透性，增加了MGF經(jīng)小鼠胃腸道的生物利用度，達(dá)到增效的目的。
　　3、結(jié)論：
　　針對MGF溶解度低且油水分配系數(shù)低的特性，圍繞MGF結(jié)構(gòu)修飾主題，通過酶催化反應(yīng)，最終找到高活性的高脂溶性的MGF前藥—PMGF，PMGF的溶解度與原型MGF相當(dāng)，但PMGF脂溶性顯著提高，抗炎藥效有優(yōu)于MGF的趨勢，有理由認(rèn)為

20、PMGF作為MGF前藥是有效的。以上研究，為MGF前藥的研究提供了新的化合物結(jié)構(gòu)類型，為有目的的開發(fā)MGF新藥奠定了基礎(chǔ)。
　　本文對難溶性藥物的開發(fā)研究亦有一定的指導(dǎo)意義。本文從通透性方面入手，提高M(jìn)GF脂溶性，動物藥效證明酯類前藥PMGF抗炎效果有優(yōu)于MGF的趨勢?？梢?，從通透性方面改善BCS4類藥物的生物利用度是行之有效的。
　　4、創(chuàng)新點：
　　(1)首次利用固定化脂肪酶Novozym435在非水相中合成了3種