葉酸靶向羥基丁酸與羥基辛酸共聚物載藥納米粒緩釋給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、眾所周知，癌癥是當(dāng)前威脅人類健康的重大疾病之一，每年僅宮頸癌就會奪去20多萬人的生命。在目前癌癥的臨床治療中，化學(xué)抗癌藥物發(fā)揮著極為重要的作用，不僅可以殺滅局部腫瘤組織，而且能夠清除全身性的癌細胞。然而，這些化療藥物對機體有著強烈的毒副作用，會給患者帶來很大的肉體與精神痛苦。因此，迫切需要設(shè)計與開發(fā)一種新型智能抗癌藥物劑型。
　　在新型抗癌藥物劑型的研發(fā)中，靶向給藥系統(tǒng)(TDDS)成為當(dāng)代智能化藥物劑型的熱門課題。該系統(tǒng)的突出特點

2、是將治療藥物定向運送到靶區(qū)，在顯著提高靶區(qū)療效的同時最大限度地減輕藥物在非靶區(qū)的毒副作用，從而實現(xiàn)高效低毒的治療策略。構(gòu)建TDDS主要包括靶向材料、載體材料、抗癌藥物及制備技術(shù)等要素。靶向材料決定著藥劑在體內(nèi)的運行方向與結(jié)合位點，是實現(xiàn)藥劑靶向功能的關(guān)鍵。載體材料關(guān)系到藥物的裝載、運輸、療效及藥代動力學(xué)，需要具備良好的生物相容性、適宜的生物可降解性和相應(yīng)的加工可行性?？拱┧幬镔x予TDDS特異的抗癌作用。而制備技術(shù)是完成TDDS研發(fā)的核心

3、要素，關(guān)系到藥劑的成型性和生產(chǎn)可行性。
　　通過查閱大量的國內(nèi)外文獻資料，分析比較了各種靶向材料、載體材料和制備技術(shù)的特點，設(shè)計了本文的研究方案?；趯m頸癌細胞表面葉酸受體(FR)過度表達的特性，選擇其相應(yīng)配體葉酸(FA)作為靶向材料。為了保證藥物運輸?shù)桨袇^(qū)并延長其作用時間，選用具有良好的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性的生物高分子聚酯—羥基丁酸與羥基辛酸共聚物[P(HB-HO)]為載體材料，以阿霉素(DOX)為模型藥物，采用W1/O/W2超

4、聲乳化法研制了葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒，檢測了納米粒的基本特性參數(shù)，并進行了其靶向性和抑瘤效果的研究。
　　研制葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒的過程分為兩個階段。第一階段合成具有靶向作用的載體材料[FA-PEG-P(HB-HO)]。根據(jù)氨基與羧基縮合形成酰胺鍵的化學(xué)反應(yīng)原理，采用二步法操作程序，首先將偶聯(lián)劑聚乙二醇二胺(H2N-PEG-NH2)與葉酸(FA)以酰胺鍵相連接，合成了FA-PEG-NH2。然后再以

5、FA-PEG-NH2與P(HB-HO)進行酰胺化反應(yīng)，合成FA-PEG-P(HB-HO)，其收率達到86.39％。運用紅外光譜(IR)和核磁共振氫譜(1H NMR)對該產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果證實FA-PEG-P(HB-HO)合成取得成功。第二階段研究了葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒的制備技術(shù)及基本特性。以納米粒粒徑作為主要指標(biāo)，比較了納米粒的不同制備方法，最終確定W1/O/W2超聲乳化法為最佳制備方法。以L9(34)正交設(shè)計法

6、優(yōu)化了W1/O/W2超聲乳化法制備納米粒的工藝條件，得出最佳的工藝條件為:阿霉素、FA-PEG-P(HB-HO)、PVA、Tween80和Span80的濃度分別為10％、6.5％、3％、5％和1％(W/V)，油相與內(nèi)水相體積比為3∶1，超聲功率為200W，超聲時間180s。對載藥納米粒的基本特性進行了檢測，結(jié)果表明:葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒的平均粒徑為241.6±9.3nm，載藥量、包封率分別為29.6±2.9％、83.5

7、±5.7％，體外累積釋藥率11d可達80％，其釋放規(guī)律符合Higuchi方程。該載藥納米粒在4℃下放置6個月后，其粒徑、載藥量及包封率均無顯著變化，穩(wěn)定性較好。
　　通過體外細胞試驗考察了納米粒對模型細胞株HeLa的細胞相容性、細胞靶向性、細胞毒性及凋亡率。HeLa細胞與納米粒進行共培養(yǎng)后，經(jīng)MTT法檢測，結(jié)果表明:空白P(HB-HO)納米粒和空白葉酸靶向P(HB-HO)納米粒均未呈現(xiàn)出細胞毒性，證明P(HB-HO)和FA-PEG

8、-P(HB-HO)具有良好的細胞相容性。當(dāng)載藥納米粒的藥物濃度范圍在0.005-50μM時，分別對游離阿霉素、P(HB-HO)載阿霉素納米粒、葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒和添加1mM游離葉酸的葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒進行了細胞毒性試驗，結(jié)果表明:葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒對HeLa細胞生長的抑制率最大，IC50最小，為0.87μM。說明葉酸對HeLa細胞具有靶向作用，由葉酸介導(dǎo)的載藥納米粒能更加有效的

9、抑制HeLa細胞的增殖。納米粒的藥物濃度、培育時間、游離葉酸影響試驗和倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果進一步證明了葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒對HeLa細胞具有靶向作用。經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒組的細胞凋亡現(xiàn)象最為嚴(yán)重。當(dāng)藥物濃度為50μM時，流式細胞儀測得葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒組的細胞凋亡率最高，達84.25±2.43％。與其它各給藥組相比，有著顯著性差異(p＜0.05)。
　　采

10、用體內(nèi)動物試驗研究了葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒在荷瘤裸鼠體內(nèi)組織的分布、靶向作用及抗腫瘤效果。構(gòu)建HeLa荷瘤裸鼠模型后隨機分組，初步研究了納米粒在體內(nèi)組織的分布及靶向作用。結(jié)果表明:將阿霉素制備成納米粒后，可以延長其在體內(nèi)的半衰期，提高機體對阿霉素的生物利用度。同時能大大降低阿霉素對心臟的毒副作用。葉酸靶向P(HB-HO)載藥納米粒組在腫瘤組織中的阿霉素濃度明顯高于其它給藥組，在48h時該組腫瘤中阿霉素濃度分別為游離阿霉素

11、組、P(HB-HO)載阿霉素納米粒組的10.81、3.33倍，說明該納米粒具有良好的腫瘤靶向性。抑瘤試驗結(jié)果表明:葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒組的瘤重與生理鹽水組相比具有極顯著性差異(p＜0.01)，其抑瘤率可達76.91％，且明顯高于其它給藥組。該組腫瘤組織在試驗期間體積增長速率最慢，實驗動物體重變化較為平穩(wěn)。試驗結(jié)束后該組瘤塊體積最小，為178.91±17.43 mm3。瘤塊組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素

12、納米粒組腫瘤細胞數(shù)目明顯減少，分布較為稀疏，可以看到腫瘤細胞嚴(yán)重壞死。由此可見，葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒具有良好的抑瘤效果。
　　通過本文研究，我們首次建立了二步法合成FA-PEG-P(HB-HO)的技術(shù)，并獲得了FA-PEG-P(HB-HO)產(chǎn)品。建立了葉酸靶向P(HB-HO)載阿霉素納米粒制備工藝，并確定了主要技術(shù)參數(shù)，研發(fā)出了一種治療宮頸癌的新型靶向給藥納米制劑。體內(nèi)外試驗結(jié)果表明，該納米粒靶向性好，對宮頸癌療