microRNA-133a在腹主動(dòng)脈瘤中的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的
　　腹主動(dòng)脈瘤(abdominalaorticaneurysm，AAA)已成為一個(gè)影響全民健康的重要疾病。在發(fā)達(dá)國(guó)家，AAA在男性人群的發(fā)病率已高達(dá)3％-9％，女性則為1％-2％。迄今為止，開(kāi)放手術(shù)或腔內(nèi)手術(shù)仍然是AAA唯一的根治方法，而即使在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)背景下，AAA破裂的死亡率仍然高達(dá)50％以上。
　　針對(duì)AAA的病因，最近國(guó)內(nèi)外的一些前沿研究正在探索采用藥物治療、基因治療甚至干細(xì)胞的方法，達(dá)到控制AAA發(fā)展，防止其破

2、裂的目的，同時(shí)為小的、無(wú)癥狀的AAA患者以及手術(shù)禁忌的AAA患者開(kāi)辟新的臨床治療途徑，并能為適于手術(shù)治療的患者創(chuàng)造有利的治療時(shí)機(jī)。microRNA(miRNA，miR)是一種內(nèi)源性的非編碼的小分子RNA，長(zhǎng)度大約18～25個(gè)核苷酸。它可以通過(guò)抑制目標(biāo)mRNA的翻譯過(guò)程或者影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性起到抑制目標(biāo)mRNA表達(dá)的作用，從而在生物體內(nèi)的各種生理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，miR參與多種細(xì)胞的增殖、成熟、分化、凋亡以及多種疾病的發(fā)生發(fā)

3、展。
　　我們前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-133a在AAA中表達(dá)下調(diào)，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)，假設(shè)miR-133a在AAA的發(fā)展中可能會(huì)起到一定的保護(hù)作用。本研究擬在體外驗(yàn)證miR-133a與血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)的關(guān)系，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察miR-133a對(duì)AAA進(jìn)展的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)材料與方法
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑
　　200～250g雄性SD(Spra

4、gue-Dawley)大鼠購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;pluronicF-127、彈力蛋白酶、二甲基亞砜購(gòu)買(mǎi)于sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)買(mǎi)于HyClone公司;下面是各種蛋白的抗體及其購(gòu)買(mǎi)公司:α-SMA（SantaCruz公司，美國(guó)），OPN（SantaCruz公司，美國(guó)），Ki67(abcom公司，美國(guó))，CTGF（SantaCruz公司，美國(guó)），DAPI（碧云天公司，中國(guó)），MMP-2、MMP-9（a

5、bcom公司，美國(guó)），lipo-2000（Invitrogen公司，美國(guó)），PDGF（美國(guó)Peprotech公司）。SP法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色液（福州邁新公司）;miR-133a專用Real-timePCR試劑盒、miR-133amimic、anti-miR-133a和Scr序列購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;人主動(dòng)脈來(lái)源VSMC購(gòu)自上海拜力生物技術(shù)有限公司。
　　二、動(dòng)物模型
　　200～250g雄性SD大鼠共30

6、只，共分為5組（每組6只），沒(méi)有干預(yù)措施的包括對(duì)照組(0h)6只，實(shí)驗(yàn)組6只。所有大鼠經(jīng)10％水合氯醛腹腔注射麻醉，成功后備皮，腹部正中切口長(zhǎng)約3cm切開(kāi)進(jìn)腹，撕開(kāi)后腹膜，自腎動(dòng)脈水平到腹主動(dòng)脈分叉處游離腹主動(dòng)脈，并結(jié)扎全部腰動(dòng)脈分支，腹主動(dòng)脈分叉處近端穿線備用，于腹主動(dòng)脈末端穿刺，近端阻斷夾阻斷，遠(yuǎn)端絲線系活結(jié)，注入彈力蛋白酶（對(duì)照組注入生理鹽水），保持張力持續(xù)5分鐘。分別于術(shù)后1、2、3、4周超聲檢查腹主動(dòng)脈直徑。給予干預(yù)措施的分為

7、三組，分為鹽水對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組和空白轉(zhuǎn)染組，方法為在注射藥物后外膜涂抹lipo-2000和F-127混合的轉(zhuǎn)染序列，取材后4％多聚甲醛固定或液氮中凍存。
　　三、EVG染色
　　主動(dòng)脈組織福爾馬林固定，二甲苯酒精脫水，石蠟包埋切片。嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)EVG步驟，在普通光學(xué)顯微鏡(TE2000-S，Nikon，Japan)下觀察結(jié)果。
　　四、VSMC細(xì)胞培養(yǎng)
　　VSMC來(lái)源于購(gòu)買(mǎi)的人主動(dòng)脈細(xì)胞，傳代3～4次后轉(zhuǎn)染及檢測(cè)

8、，培養(yǎng)置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，應(yīng)用含10％血清的高糖DMEM培養(yǎng)。
　　五、細(xì)胞及組織免疫熒光染色
　　VSMC以104密度生長(zhǎng)于24孔板或玻片上，PBS洗滌3次，用多聚甲醛固定，5％BSA室溫封閉2小時(shí)，一抗4℃孵育過(guò)夜，熒光標(biāo)記二抗室溫孵育2小時(shí)，Hoechst33258染核。在倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微成像下觀察染色情況(FV1000S-SIM/IX81，Olympus，Japan)。主動(dòng)脈采用冰凍切片染

9、色，一抗4℃孵育過(guò)夜，熒光標(biāo)記二抗室溫孵育2小時(shí)，DAPI染核。
　　六、免疫組織化學(xué)檢測(cè)
　　石蠟切片行免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠腹主動(dòng)脈中MMP-2、MMP-9、CTGF的表達(dá)。
　　七、Western-Blot
　　主動(dòng)脈組織標(biāo)本或VSMC置于EP管中，加入適量蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF)，勻漿機(jī)勻漿或超聲破碎細(xì)胞，離心后提取蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白上樣量為60μg，體積為20μl。配

10、制10％聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉（5％脫脂牛奶）、加入一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜45分鐘，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)37℃孵育2小時(shí)后ECL發(fā)光(MF-ChemiBis)，并計(jì)算光密度值。試驗(yàn)重復(fù)3次。
　　八、real-timePCR檢測(cè)miR-133a的表達(dá)
　　Trizol法提取實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞及主動(dòng)脈組織總RNA，異丙醇濃縮RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度。取2μL總RNA，用rno-miR-133aHa

11、irpin-itTMReal-TimePCRKit按操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)，U6作為內(nèi)參。
　　九、脂質(zhì)體介導(dǎo)的miR轉(zhuǎn)染
　　應(yīng)用lipo-2000轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在熒光顯微鏡(FV1000S-SIM/IX81;Olympus)下觀察GFP熒光標(biāo)記，明確轉(zhuǎn)染效率。
　　十、細(xì)胞遷移檢測(cè)
　　VSMC鋪6孔板，轉(zhuǎn)染后24h更換培養(yǎng)基，垂直孔方向劃線，分別于4、6、8、1

12、2h觀察細(xì)胞遷移情況。
　　十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、miR-133a在合成型VSMC中表達(dá)下調(diào)
　　以同步化后的VSMC作為0小時(shí)組，加入小劑量PDGF（10ng/ul）及含血清DMEM培養(yǎng)基刺激48小時(shí)后為48h組，再次更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)后作為72h組，real-timePCR結(jié)果顯示

13、48h組miR-133a在48h組表達(dá)明顯下調(diào)，72h組基本恢復(fù)到0小時(shí)組水平。
　　二、miR-133a可以抑制VSMC的增殖和遷移
　　為研究miR-133a與VSMC增殖和遷移的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)分三組轉(zhuǎn)染VSMC:miR-133amimic組、anti-miR-133a組及Scr組（陰性對(duì)照），通過(guò)免疫熒光染色證實(shí)增殖蛋白Ki-67的表達(dá)受miR-133a下調(diào)，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-133a可以抑制VSMC的遷移。

14、>　　三、miR-133a可以維持VSMC收縮型表型，抑制VSMC合成型標(biāo)記物的表達(dá)
　　采用免疫熒光染色證實(shí)在miR-133amimic組，VSMC收縮型的表型標(biāo)記物a-SMA表達(dá)明顯比anti-miR-133a組高，而合成型標(biāo)記物OPN的表達(dá)則明顯下調(diào)，Western-blot的結(jié)果得到同樣趨勢(shì)。
　　四、miR-133a在腹主動(dòng)脈瘤中的表達(dá)下調(diào)
　　Real-timePCR檢測(cè)大鼠AAA標(biāo)本提示miR-133a在

15、腹主動(dòng)脈瘤中的表達(dá)明顯比對(duì)照組和正常主動(dòng)脈降低。
　　五、miR-133a體內(nèi)轉(zhuǎn)染可以抑制大鼠腹主動(dòng)脈瘤的進(jìn)展
　　大鼠腹主動(dòng)脈灌注彈性蛋白酶后，應(yīng)用lip-2000混合F-127作為載體，將miR-133a及對(duì)照序列體內(nèi)轉(zhuǎn)染至腹主動(dòng)脈外膜，術(shù)后超聲測(cè)量主動(dòng)脈直徑，real-timePCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，與對(duì)照序列相比，體內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-133a可以明顯抑制造模一周后的大鼠腹主動(dòng)脈直徑，但相比灌注鹽水的陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染組

16、大鼠腹主動(dòng)脈直徑仍有增大。
　　六、miR-133a體內(nèi)轉(zhuǎn)染的大鼠腹主動(dòng)脈的組織學(xué)檢測(cè)
　　免疫熒光染色提示在miR-133a轉(zhuǎn)染組，主動(dòng)脈壁中的VSMC合成型標(biāo)記物OPN明顯比空白轉(zhuǎn)染組下調(diào)，而SMA的表達(dá)上調(diào)，提示miR-133a在體內(nèi)可以抑制AAA的進(jìn)展。免疫組化顯示miR-133a轉(zhuǎn)染組動(dòng)脈壁中MMP-2、9表達(dá)明顯下調(diào)。Western-blot的結(jié)果一致。
　　七、miR-133a可能通過(guò)抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

17、(CTGF)抑制大鼠腹主動(dòng)脈瘤
　　理論預(yù)測(cè)CTGF可能存在miR-133a的結(jié)合位點(diǎn)，在體外，miR-133a的轉(zhuǎn)染可以抑制CTGF的表達(dá)，在體內(nèi)，miR-133a轉(zhuǎn)染組的CTGF同樣表達(dá)下降。
　　結(jié)論
　　一、miR-133a在合成型VSMC中表達(dá)下調(diào)
　　二、miR-133a可以抑制VSMC的增殖和遷移
　　三、miR-133a可以維持VSMC收縮表型，抑制VSMC合成型標(biāo)記物的表達(dá)
　　四、