1、熱激蛋白(HSP)是一種具有廣泛抗逆作用的保護性蛋白，主要作為分子伴侶在細(xì)胞保護、光合作用、遺傳繁育和脅迫應(yīng)激等過程中發(fā)揮重要作用。本文分析了紫花苜蓿熱激蛋白基因MsHSP70的特性及功能，旨在為苜蓿遺傳改良與抗逆品種選育提供理論依據(jù)。主要實驗結(jié)果如下:
1、利用同源克隆法，從紫花苜?？寺×艘粋€全長為2146 bp熱激蛋白基因序列，命名為MsHSP70(GenBank accession No:KJ621409)。經(jīng)生物信息學(xué)
2、分析，該基因包含一個2028 bp開放閱讀框，可編碼675個氨基酸，MsHSP70蛋白分子量為72.33 KDa，蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β折疊組成。多序列比對結(jié)果顯示MsHSP70與截形苜蓿、豌豆、擬南芥HSP70的相似度分別為:94.47％、89.93％、78.72％。
2、通過亞細(xì)胞定位分析及在線預(yù)測，MsHSP70基因可定位于線粒體，經(jīng)過進化樹分析可將MsHSP70歸類到線粒體HSP70家族。成功構(gòu)建了MsHSP70
3、基因原核表達載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下在大腸桿菌中大量表達，聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明MsHSP70原核表達蛋白分子量與預(yù)測結(jié)果一致。
3、利用實時熒光定量PCR對MsHSP70基因在苜蓿不同組織和非生物脅迫下的表達模式進行了分析，結(jié)果表明，MsHSP70在紫花苜蓿的花中表達量最大，莖和葉次之，根中最少;MsHSP70基因的表達受高溫、ABA、H2O2誘導(dǎo)，干旱和鹽脅迫下基因表達量沒有顯著變化。
4、構(gòu)建了
4、植物表達重組載體pCAMBIA1302-MsHSP70，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了擬南芥和紫花苜蓿，經(jīng)過抗性篩選和分子檢測，初步鑒定已獲得轉(zhuǎn)MsHSP70基因擬南芥和紫花苜蓿。
5、通過對轉(zhuǎn)MsHSP70基因擬南芥中MsHSP70基因表達分析，結(jié)果顯示MsHSP70基因受ABA、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達;對T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗逆性分析顯示，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥在ABA和干旱脅迫下均表現(xiàn)為:丙二醛(MDA)含量較低，脯氨酸
