基質(zhì)金屬蛋白酶-3基因啟動子區(qū)多態(tài)與散發(fā)性腦動靜脈畸形的遺傳易感性分析與功能研究.pdf

1、[目的]
　　探索基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinases3，MMP3）基因啟動子區(qū)多態(tài)與散發(fā)性腦動靜脈畸形(Brain arteriovenous malformation，BAVM)的遺傳易感性，并研究MMP基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)的生物學(xué)功能。
　　[方法]
　　MMP3是基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metal

2、loproteinases，MMP)家族中的重要成員，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，參與血管重塑與再生，可能在BAVM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題首先通過數(shù)據(jù)庫檢索，選擇了5個(gè)在中國人群中高頻分布的潛在MMP3基因功能性SNP位點(diǎn)，通過病例-對照進(jìn)行研究。經(jīng)檢測319例BAVM患者和333例健康對照組的血液標(biāo)本，確定了與BAVM發(fā)病相關(guān)的MMP3基因啟動子區(qū)SNP位點(diǎn)-709A＞G(rs522616)。其次，對該位點(diǎn)A＞G突變降低BAVM

3、發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。本課題采用構(gòu)建含有-709A、-709G以及位點(diǎn)突變的pGL3-A、pGL3-G和pGL3-mutant熒光素酶報(bào)告載體，分別轉(zhuǎn)染HEK293和HUVEC細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，分析該SNP位點(diǎn)不同等位基因所導(dǎo)致的MMP3基因轉(zhuǎn)錄活性的不同。再通過添加含有-709A、-709G的競爭性DNA片段，分析pGL3-A受干擾后的轉(zhuǎn)錄活性，比較這兩種等位基因與轉(zhuǎn)錄因子之間結(jié)合力的強(qiáng)弱。然后通過生物信息學(xué)軟件確定與該

4、MMP基因啟動子區(qū)SNP結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子為c-myb，并通過構(gòu)建其過表達(dá)熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染、染色質(zhì)免疫共沉淀和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，檢測c-myb對MMP3基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，并在BAVM組織中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　[結(jié)果]
　　通過分子流行病學(xué)調(diào)查，BAVM病例組與對照組在年齡和性別上分別匹配(p=0.062&0.945)，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在檢索分析獲得的5個(gè)SNP位點(diǎn)中，MMP3基因啟動子區(qū)-709bp SNP位點(diǎn)rs522616

5、A＞G在BAVM病例和對照組中存在顯著差異(P=0.02)，攜帶rs522616 AG雜合基因型的個(gè)體與AA基因型攜帶者相比，BAVM的患病風(fēng)險(xiǎn)降低了38％(Adjusted OR=0.62，95％ CI=0.44-0.87，P=0.006)。轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在HEK293細(xì)胞中，G等位型的熒光素酶活性較A相比顯著下降了2.67倍(P＜0.01);在HUVEC細(xì)胞中，G等位型也下降了5.89倍(P＜0.05)。在競爭實(shí)驗(yàn)中，A比G競爭

6、片段可以更大程度降低pGL3-A轉(zhuǎn)錄的熒光素酶活性(Aportion vs G portion=0.503-fold vs0.756-fold，P=0.01)。提示A＞G的突變降低了MMP3基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性以及與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合力。通過生物信息學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)在MMP3基因啟動子區(qū)SNP rs522616周圍6個(gè)堿基TTCAAT是轉(zhuǎn)錄因子c-myb的結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞水平上過表達(dá)c-myb，可以使得pGL3-A的熒光素酶活性在HEK293

7、及HUVEC細(xì)胞中分別提高了1.7倍和1.2倍(P＜0.05)，而不能明顯提高pGL-G的轉(zhuǎn)錄活性。染色質(zhì)免疫共沉淀和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在細(xì)胞系以及BAVM組織中，轉(zhuǎn)錄因子c-myb與包含-709A等位型的MMP啟動子區(qū)域結(jié)合更為緊密。
　　[結(jié)論]
　　本研究首次提出MMP3基因啟動子區(qū)SNP-709 A＞G(rs522616)可能可以降低BAVM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，該保護(hù)作用的機(jī)制在于-709 A＞G的突變能減弱MMP3基因啟動