BCR-ABL1陽性微泡的生物學(xué)功能和臨床檢測意義.pdf

1、本文對BCR-ABL1陽性微泡的生物學(xué)特征及內(nèi)容物進(jìn)行分析。
　　目的：微泡(MV)是一種新型的細(xì)胞間信息交流載體，具有豐富的生物學(xué)功能；MV的生物學(xué)功能由其攜帶的內(nèi)容物決定，不同應(yīng)激條件下MV的內(nèi)容物存在較大差異，是細(xì)胞的一種適應(yīng)性機(jī)制。本部分研究擬以K562細(xì)胞為代表，了解慢性髓性白血病(CML)來源MV的生物學(xué)特性以及主要包含的內(nèi)容物，明確其功能指向；同時探討應(yīng)激狀態(tài)下K562細(xì)胞及其MV中miRNA表達(dá)譜等內(nèi)容物的改變。<

2、br>　　方法：體外培養(yǎng)K562細(xì)胞，采用梯度離心法收集MV；離心獲得的沉淀物以透射電鏡觀察，流式細(xì)胞儀分析其大小和表面標(biāo)志，同時采用PKH-26及CFSE等熒光染料染色沉淀物后于激光共聚焦和熒光顯微鏡下觀察；經(jīng)鑒定是MV后提取其中的RNA，實(shí)時定量PCR檢測其中的BCR-ABL1表達(dá)，熒光原位雜交(FISH)檢測其中的染色體片段；在此基礎(chǔ)上，采用低血清培養(yǎng)刺激K562細(xì)胞并收集其來源的MV，以正常培養(yǎng)的K562細(xì)胞及其MV作為對照，芯

3、片檢測四個樣本中的miRNA表達(dá)譜；對比分析不同狀態(tài)下MV中miRNA表達(dá)譜的差異，生物信息學(xué)分析差異miRNA分子可能參與的生物學(xué)行為。最后，構(gòu)建自主創(chuàng)新的小鼠骨質(zhì)移植微小殘留病(MRD)模型，實(shí)時定量PCR方法定期檢測小鼠外周血細(xì)胞及MV中BCR-ABL1水平。
　　結(jié)果：我們采用梯度離心方法獲取的沉淀物，經(jīng)透射電鏡、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)為一種直徑0.1-1.0μm的游離于細(xì)胞外的雙層脂質(zhì)小囊泡結(jié)構(gòu)，攜帶有母體細(xì)胞

4、的細(xì)胞器和部分細(xì)胞質(zhì)，符合國內(nèi)外文獻(xiàn)對MV的定義。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，K562-MV大小均小于1.0μm，主要分布區(qū)間為0.3μm，0.5μm和0.8μm，表面表達(dá)大量的Annexin V分子。實(shí)時定量PCR證明K562-MV中可檢出BCR-ABL1 mRNA，F(xiàn)ISH結(jié)果發(fā)現(xiàn)MV中攜帶Ph染色體片段。利用K562細(xì)胞成功構(gòu)建同種骨質(zhì)移植小鼠MRD模型，腫瘤細(xì)胞在同種移植骨質(zhì)中能夠存活約10周；定期檢測外周血細(xì)胞及MV中BCR-ABL1

5、發(fā)現(xiàn)，基于細(xì)胞檢測持續(xù)陰性時，MV中BCR-ABL1水平卻逐漸升高，提示MV極有可能優(yōu)先于細(xì)胞進(jìn)入外周血。miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，饑餓應(yīng)激后K562細(xì)胞中miR-1826、miR-1、miR-1979、miR-92b等分子水平下降，其作用靶點(diǎn)主要為VEGF、Wnt等通路，可能與維持自身存活信號相關(guān)；饑餓后的K562-MV中這部分miRNA分子表達(dá)水平升高，推測 K562細(xì)胞接受饑餓刺激后可能通過 MV外排大量miRNA降低自身表達(dá)水平

6、，是細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境改變的適應(yīng)性新機(jī)制。此外，K562-MV中高表達(dá)的部分miRNA（如miR-125b）具有顯著的促癌效應(yīng)，提示這部分MV可能具有惡性轉(zhuǎn)化其他正常細(xì)胞的功能。
　　結(jié)論：我們在這部分研究中成功分離并鑒定了K562-MV并初步闡明了其中的內(nèi)容物組成；應(yīng)激條件下，MV可能是細(xì)胞通過非降解途徑外排多種物質(zhì)(尤其是miRNA分子)的關(guān)鍵介質(zhì)；K562-MV中負(fù)載大量致癌性miRNA及BCR-ABL1 mRNA，可能具有惡性轉(zhuǎn)