hEGF生物活性新型蠶絲材料的創(chuàng)制與研究.pdf

1、蠶絲作為一種紡織材料，因光澤柔和、吸濕保暖性好、易于加工、舒適度好且能通過印染輕松染色等優(yōu)點(diǎn)在服裝紡織行業(yè)享有美譽(yù)。同時(shí)，蠶絲作為一種理想的生物材料，因獨(dú)特的機(jī)械性能、良好的生物相容性、較強(qiáng)的環(huán)境穩(wěn)定性和可緩慢降解等特性，逐漸在醫(yī)學(xué)和生物組織工程領(lǐng)域嶄露頭角。然而，天然蠶絲仍舊存在染色牢固度差、易脫色、機(jī)械性能遠(yuǎn)不及蜘蛛絲纖維、其醫(yī)學(xué)材料特性依舊滿足不了當(dāng)前醫(yī)學(xué)組織工程研究需要等缺陷。為了改善天然蠶絲存在的上述缺陷，研究人員們建立了基于

2、piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶絲腺特異啟動(dòng)系統(tǒng)，探索利用轉(zhuǎn)基因家蠶創(chuàng)造具有新型功能蠶絲材料的可行性，例如通過在家蠶絲腺表達(dá)熒光蛋白，獲得在自然光下即可呈現(xiàn)綠色、紅色或橘色的轉(zhuǎn)基因彩色蠶絲;通過在絲腺表達(dá)外源蜘蛛絲蛋白或多肽，獲得機(jī)械性能增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因蠶絲;通過絲腺表達(dá)不同醫(yī)用目的的外源蛋白和多肽，獲得細(xì)胞粘連性、生物相容性或鈣離子吸附能力提高的具有特定新功能的轉(zhuǎn)基因醫(yī)學(xué)蠶絲材料。但是，利用上述方法獲得的蠶絲材料仍有不足，轉(zhuǎn)基因彩色蠶絲出現(xiàn)了

3、機(jī)械性能的下降，轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因獲得的蠶絲機(jī)械性能增強(qiáng)不顯著，醫(yī)用蠶絲材料中表達(dá)的目的蛋白不具有生物學(xué)活性等。人表皮生長因子（human epidermal growth factor, hEGF）是廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一類多肽物質(zhì)，能極強(qiáng)的促進(jìn)各種表皮細(xì)胞的生長，在醫(yī)學(xué)上用于燒燙傷、潰瘍、各類創(chuàng)傷以及角膜損傷的治療。為了探究能否利用家蠶絲腺特異啟動(dòng)系統(tǒng)表達(dá)出具有生物學(xué)活性的hEGF，從而獲得具有hEGF生物學(xué)活性的蠶絲材料。我們基于本

4、研究團(tuán)隊(duì)2010年獲得的絲素重鏈高效表達(dá)載體R3，構(gòu)建了兩個(gè)不同絲腺特異表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)基因擬期創(chuàng)制具有hEGF生物活性新型蠶絲材料。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艃煞NhEGF-重鏈融合蛋白轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建。家蠶絲素重鏈表達(dá)載體R3，主要由絲素重鏈基因N端、C端序列以及中間融合表達(dá)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因構(gòu)成，在表達(dá)載體R3的基礎(chǔ)上，我們用hEGF基因?qū)GFP基因替換，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac{Fib-H P3-

5、hEGF-LBS;3×P3-DsRed}；在hEGF-重鏈融合蛋白能夠正常加工和分泌的前提下，將信號(hào)肽切割位點(diǎn)(Cs)下游的重鏈N端序列以及參與蛋白分泌的半胱氨酸(Cys)上游的重鏈C端序列盡數(shù)截去，構(gòu)建了另一個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac{Fib-H P3(s)-hEGF-LBS(s);3×P3-DsRed}。
　?、苃EGF轉(zhuǎn)基因品系的建立和分子鑒定。通過家蠶顯微注射的方法，將hEGF-重鏈融合蛋白轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體和輔助質(zhì)粒pHA3P

6、IG共同導(dǎo)入家蠶實(shí)用品種871非滯育的G0代早期胚胎中，并利用體式熒光顯微鏡對(duì)回交產(chǎn)生的G1代蠶卵胚胎和蠶蛾眼部進(jìn)行紅色熒光的篩選。將載體pBac{Fib-H P3-hEGF-LBS;3×P3-DsRed}注射獲得的轉(zhuǎn)基因系命名為TSL-P;將載體pBac{Fib-H P3(s)-hEGF-LBS(s);3×P3-DsRed}注射獲得的轉(zhuǎn)基因系命名為TSL-P(s)。其中TSL-P陽性率為11/60(18.3％)，TSL-P(s)陽性率

7、為7/31(22.6％)。通過Southernblotting和Inverse PCR對(duì)TSL-P和TSL-P(s)共18個(gè)陽性品系個(gè)體的外源基因片段插入拷貝數(shù)和位置進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中轉(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF純蛋白含量最高的TSL-P-2和TSL-P(s)-7兩個(gè)品系都是單拷貝，分別插入在家蠶9號(hào)和8號(hào)染色體上。
　?、寝D(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF-重鏈融合蛋白的分子檢測。利用0.6 g mL-1LiSCN溶液溶解蠶繭、離心取上清獲得蠶絲蛋白樣品

8、，并通過SDS-PAGE和Western blotting對(duì)蠶絲蛋白樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明:1、hEGF-重鏈融合蛋白均已在TSL-P和TSL-P(s)轉(zhuǎn)基因家蠶后部絲腺表達(dá)并參與蠶繭的形成，并且TSL-P轉(zhuǎn)基因蠶繭中hEGF蛋白含量的平均值(4.9％)遠(yuǎn)大于TSL-P(s)(2.1％)，其中TSL-P-2和TSL-P(s)-7 hEGF純蛋白的含量最高，分別為16.7％和3.0％;2、hEGF-重鏈融合蛋白的實(shí)際分子質(zhì)量，TSL-P大

9、于預(yù)測值，而TSL-P(s)與預(yù)測值大小一致，該結(jié)果表明TSL-P轉(zhuǎn)基因系融合蛋白可能存在磷酸化、甲基化等后期加工修飾過程，結(jié)合之前研究結(jié)果可以推斷出后期加工修飾的區(qū)域就是位于本研究中被截去的絲素重鏈C段序列。
　?、绒D(zhuǎn)基因蠶絲中hEGF生物學(xué)活性檢測。利用55℃堿液對(duì)轉(zhuǎn)基因蠶絲材料進(jìn)行脫膠處理，并對(duì)脫膠后的蠶絲材料是否具有hEGF生物學(xué)活性進(jìn)行檢測。將浸泡過脫膠蠶絲的細(xì)胞培養(yǎng)基用于人表皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，通過Brdu免疫熒光對(duì)細(xì)

10、胞分裂率進(jìn)行分析;將相同質(zhì)量和體積的脫膠繭片鋪在人表皮成纖維細(xì)胞表面進(jìn)行共培養(yǎng)，5天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行MTT增值分析。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，TSL-P(s)轉(zhuǎn)基因蠶絲中的融合蛋白具有hEGF的生物學(xué)活性，可以促進(jìn)人表皮成纖維細(xì)胞的分裂和增殖，而TSL-P轉(zhuǎn)基因系蠶繭中的融合蛋白幾乎沒有生物學(xué)活性。本研究利用家蠶絲素重鏈表達(dá)載體成功在蠶絲中表達(dá)了hEGF-重鏈融合蛋白，獲得一種具有hEGF生物學(xué)活性的轉(zhuǎn)基因蠶絲材料。該研究結(jié)果可以為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在