甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1,MCT8在2VO大鼠腦組織中的表達(dá).pdf

1、研究目的
　　 近年來(lái)，血管性認(rèn)知障礙(Vascularcognitiveimpairment，VCI)越來(lái)越受到人們的重視，血管性癡呆(Vasculardementia，VD)是其中的類型之一，它在老年期癡呆的分類中占一定的比重。缺血性病變尤其是多發(fā)性腦梗塞是VD的主要病理基礎(chǔ)，但VD的具體發(fā)病機(jī)制還在探索中。據(jù)臨床觀察顯示VD患者存在血清甲狀腺激素(Thyroidhormone，TH)水平異常，而臨床并無(wú)甲狀腺功能低下的表現(xiàn)

2、，多數(shù)研究認(rèn)為此現(xiàn)象屬于非甲狀腺疾病綜合征(Nonthyroidalillnesssyndrome，NTIS)。眾所周知，哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為甲狀腺激素活動(dòng)的重要靶組織，依賴于甲狀腺激素的供應(yīng)。在嚙齒類動(dòng)物腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，甲狀腺激素的缺乏可影響神經(jīng)元的遷移，生長(zhǎng)，分化，突觸的發(fā)生，髓鞘的形成及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。既往多項(xiàng)研究已證明腦內(nèi)存在相對(duì)獨(dú)立的甲狀腺激素代謝系統(tǒng)，甲狀腺激素的生物活性很大程度上取決于與細(xì)胞核受體結(jié)合的T3的濃

3、度。以前一直認(rèn)為碘化甲腺氨酸可以直接擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，但近30年甲狀腺激素的分子生物學(xué)研究表明:甲狀腺激素主要通過(guò)甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)出細(xì)胞。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1C1(Organicaniontransportingpolypeptide1C1，OATP1C1)，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8(Monocarboxylatetransporter8，MCT8)是目前被認(rèn)為是與甲狀腺激素具有高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)體。本課題組前期研究應(yīng)用大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)(

4、2-vesselocclusion，2VO)制備慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，發(fā)現(xiàn)2VO5周大鼠可發(fā)生中樞甲狀腺激素水平的異常并同時(shí)伴有認(rèn)知障礙，補(bǔ)充外源性甲狀腺激素的慢性腦缺血大鼠的水迷宮成績(jī)明顯改善，提示慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙與中樞甲狀腺激素水平下降有關(guān)，但2VO大鼠中樞甲狀腺激素水平下降是否受甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1與MCT8的調(diào)控尚無(wú)研究報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)觀察OATP1C1與MCT8在正常大鼠腦組織中的表達(dá)并探討它們?cè)?VO術(shù)后

5、不同缺血時(shí)間點(diǎn)基因與蛋白水平的變化規(guī)律。
　　 研究方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組:30只清潔級(jí)成年雄性SD大鼠，隨機(jī)選擇其中5只正常大鼠用于免疫熒光，其余25只正常大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(normal，n＝5)，2VO3天組(A，n=5)，2VO2周組(B，n＝5)，2VO5周組(C，n＝5)，2VO8周組(D，n＝5)。
　　 2.采用免疫熒光法觀察OATP1C1，MCT8在正常大鼠側(cè)腦室中的表達(dá)。
　　

6、3.各組大鼠于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)采用熒光定量PCR法(Real-timeQuantitativePCR)測(cè)定腦組織中TH轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1mRNA和MCT8mRNA的表達(dá)水平。
　　 4.各組大鼠于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)采用免疫印跡法(Westernblotting)測(cè)定腦組織中TH轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1和MCT8的蛋白表達(dá)水平。
　　 5.數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，組間比較采用單因素方差(

7、one-wayANOVA)分析，組間多重比較采用Dunnetts3法，以P＜0.05為差異顯著性檢驗(yàn)界限。
　　 研究結(jié)果
　　 1.免疫熒光法觀察到OATP1C1，MCT8在正常大鼠側(cè)腦室的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上表達(dá)豐富。
　　 2.與正常組相比較，甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1mRNA水平在2VO3天組，2VO2周組及2VO8周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000，P=0.604，P=0.448)，在2VO5周組差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.011);與2VO3天組比較，OATP1C1mRNA水平在2VO2周組及2VO8周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.456，P=0.427)，在2VO5周組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=O.012);與2VO2周組比較，OATP1C1mRNA水平在2VO5周組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)，在2VO8周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.718);與2VO5周組比較，OATP1C1mRNA水平在2VO8周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.414)

9、。
　　 3.與正常組相比較，甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT8mRNA水平在2VO3天組，2VO2周組及2VO8周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000，P=0.984，P=0.052)，在2VO5周組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.046);與2VO3天組比較，MCT8mRNA水平在2VO2周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.883)，在2VO5周及2VO8周組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042，P=0.031);與2VO2周組比較，MCT8mRNA水

10、平在2VO5周組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.054)，在2VO8周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.351);與2VO5周組比較，MCT8mRNA水平在2VO8周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.135)。
　　 4.免疫印跡法檢測(cè)所示在2VO2周組，2VO5周組，2VO8周組條帶均較正常組與2VO3天組加深，這表明2VO術(shù)后隨著大鼠腦組織缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1和MCT8蛋白在腦組織中的表達(dá)增加。
　　 研究結(jié)論

11、
　　 眾所周知甲狀腺激素的生物活性是由細(xì)胞內(nèi)的T3濃度決定的，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)T3進(jìn)入中樞神經(jīng)元有兩種途徑，一種是:1)T4在OATP1C1的參與下通過(guò)血腦屏障;2)T4通過(guò)不知名的運(yùn)載體進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;3)T4在D2脫碘酶的作用下轉(zhuǎn)化為T(mén)3;4)T3通過(guò)不知名的運(yùn)載體從神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中被釋放;5)T3被運(yùn)載體MCT8或另一種載體轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元。另一種途徑是:1)T3由轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT8轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)血腦屏障，再經(jīng)過(guò)MCT8或另一種載體攝取

12、至神經(jīng)元。人類SLCO1C1基因編碼OATP1C1蛋白，OATP1C1蛋白包含712個(gè)氨基酸，有12個(gè)跨膜區(qū)，OATP1C1主要表達(dá)在腦組織的血腦屏障和脈絡(luò)從，主要轉(zhuǎn)運(yùn)T4、rT3和極少量的T3，與T4有高度的特異性，它是T4進(jìn)入腦組織的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體，其種屬間有顯著差異，大鼠、小鼠的表達(dá)高于人類。人類MCT8(SLC16A2)基因位于Xq13.2包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。成熟的mRNA長(zhǎng)約4.4kb，包含2個(gè)翻譯起始位點(diǎn)(TLSs)。由

13、于TLS不同，人類MCT8基因編碼的蛋白有兩種:一種含有613個(gè)氨基酸，另一種是含有539個(gè)氨基酸。非靈長(zhǎng)類MCT8基因缺乏第1位TLS，但第二位與人類同源。MCT8有12個(gè)跨膜區(qū)，其N端和C端都位于細(xì)胞內(nèi)。N端富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基(簡(jiǎn)稱PEST)，539個(gè)氨基酸的蛋白N端含有1個(gè)PEST;613個(gè)氨基酸的蛋白N端含有2個(gè)PEST。因此MCT8也稱為X連鎖含有PEST的轉(zhuǎn)運(yùn)體(X-linkedPEST—containi

14、ngtransporter.XPCT)。MCT8在不同種屬、不同組織中廣泛分布，如腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、甲狀腺、胎盤(pán)。MCT8基因突變導(dǎo)致的AHDS綜合征(Allan-Herndon-Dudleysyndrome)——一類伴有血清T3水平升高的X連鎖精神運(yùn)動(dòng)性遲緩綜合癥——使得MCT8在腦發(fā)育中的作用日益受到重視。目前認(rèn)為甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT8是最具特異性的T3轉(zhuǎn)運(yùn)體。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光法觀察到中樞甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C

15、1，MCT8均豐富地表達(dá)于正常大鼠大腦側(cè)腦室的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，這與之前的研究一致。OATP1C1與MCT8在成年大鼠脈絡(luò)叢中的高度表達(dá)，提示它們?cè)谘X屏障或血腦脊液屏障轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺激素中發(fā)揮著重要作用。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血(2VO5周)成年大鼠發(fā)生認(rèn)知障礙，同時(shí)腦組織T3、T4濃度下降，而在急性期及慢性期補(bǔ)充外源性甲狀腺激素的2VO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均明顯改善，提示慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙與中樞甲狀腺激素

16、水平下降有關(guān)，但是2VO大鼠中樞甲狀腺激素水平下降是否受甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1與MCT8的調(diào)控尚無(wú)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR法檢測(cè)OATP1C1與MCT8在不同缺血時(shí)間點(diǎn)的大鼠大腦中基因水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)OATP1C1，MCT8基因水平呈不同程度的代償性增加的趨勢(shì)，并在缺血5周時(shí)達(dá)高峰，這表明大鼠在腦缺血5周時(shí)腦組織對(duì)甲狀腺激素的需求顯著增加，與我們前期觀察到的2VO5周大鼠腦組織T3、T4濃度下降相對(duì)應(yīng)

17、，說(shuō)明OATP1C1與MCT8在轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺激素通過(guò)血腦屏障及血脈絡(luò)叢屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)、及時(shí)補(bǔ)充及代償中樞缺失的甲狀腺激素方面發(fā)揮著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用Westernblotting法檢測(cè)OATP1C1與MCT8在在不同缺血時(shí)間點(diǎn)的大鼠大腦中蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)OATP1C1與MCT8蛋白水平呈不同程度的代償性增加的趨勢(shì)，此結(jié)果與基因水平的變化基本一致。
　　 盡管隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)OATP1C1與MC

18、T8基因水平與蛋白呈不同程度的代償性增加的趨勢(shì)，但依然不足以代償缺血大鼠腦組織中減少的甲狀腺激素，原因可能有以下幾點(diǎn):1.隨著腦組織缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠的血腦屏障(Blood-brainbarrier,BBB)和脈絡(luò)膜-腦脊液屏障(ChoroidPlexus-Cerebrospinalfluidbarrier，CP-CSFB)產(chǎn)生不同程度的損傷，因而影響B(tài)BB和CP-CSFB上皮細(xì)胞內(nèi)的OATP1C1與MCT8的代償能力;2.是否腦缺血

19、時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)甲狀腺激素的代謝過(guò)程還存在著其它環(huán)節(jié)的異常，這有待更進(jìn)一步的研究。
　　 總之，從本實(shí)驗(yàn)中，我們看到，中樞甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1C1，MCT8都豐富地表達(dá)于大腦側(cè)腦室脈絡(luò)叢的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，這提示它們?cè)谘X屏障或血腦脊液屏障轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺激素中發(fā)揮著重要作用。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)OATP1C1與MCT8基因水平與蛋白呈不同程度的代償性增加的趨勢(shì)，雖然不足以代償缺血大鼠腦組織對(duì)甲狀腺激素的需求，但是間接反映了腦缺