福建牡蠣(Crassostrea angulata)銅富集相關基因的研究.pdf

1、牡蠣是具有重要經濟價值的海水養(yǎng)殖品種，在世界很多地區(qū)都有養(yǎng)殖。而我國牡蠣養(yǎng)殖產量居世界首位。同時，牡蠣對銅、鋅等金屬具有很強的富集能力，經常被用于指示河口污染情況。隨著工業(yè)發(fā)展，近岸河口區(qū)遭受越來越嚴重的金屬污染，銅就是其中非常有代表性的金屬污染物。因此牡蠣對銅的超富集現象越來越被人們所關注。學者們發(fā)現牡蠣對銅富集存在非常大的個體差異，然而相關的研究卻非常有限，特別是缺少分子機制的解析。對這一現象的深入研究不但可以探尋、豐富牡蠣銅富集相

2、關機制，更可以為選育牡蠣不同金屬富集能力品系提供理論依據，有著非常重要的科研與生產價值。本研究選取我國南方牡蠣養(yǎng)殖的主要種類福建牡蠣(Crassostrea angulata)作為研究對象，對其銅富集個體差異進行分子生物學與實驗生態(tài)學的研究，以轉錄組分析的方法尋找相關功能基岡并進一步進行驗證。并且進一步研究了福建牡蠣銅富集個體差異是否可以遺傳給后代。本研究主要結果如下:
　　1.福建牡蠣銅富集差異個體的轉錄分析
　　選取了兩

3、組存在銅富集差異(3-4倍)福建牡蠣的鰓和外套膜進行基因轉錄水平分析，共發(fā)現372個差異表達基因。對這些基因進行功能注釋和GO富集，它們集中在神經遞質載體蛋白基因、ATP結合盒轉運體(ABC)基因家族、多銅氧化酶基因以及一些脂類轉運基因。而和銅毒性所引起的氧化損傷相關應激基因并沒有差異表達。根據這些結果推測，牡蠣神經遞質轉運體基因的差異表達，可以影響牡蠣神經系統(tǒng)調控的生理行為，從而改變銅的富集動力學過程，產生銅富集差異現象。和銅離子結合

4、、轉運相關的基因表達量顯著上調，則使銅富集量高的牡蠣個體能夠保證細胞內銅穩(wěn)態(tài)，免受銅的毒害。
　　2.神經遞質GABA轉運體2(GAT2)在牡蠣銅富集中的作用
　　根據轉錄分析結果，選取神經遞質轉運體GAT2基因作為潛在功能基因進行研究。首先克隆獲得了GAT2基因cDNA片段。接著發(fā)現在該基因沉默后，牡蠣鰓和外套膜中銅富集量顯著降低，而在GABA受體拮抗劑注射后牡蠣銅富集量顯著升高，同時牡蠣濾水率和排氨率在GABA注射后呈現

5、劑量依賴性降低。這表明，神經遞質GABA可以調控牡蠣鰓和外套膜的生理行為，影響牡蠣對銅的富集，而神經系統(tǒng)中GABA濃度則由其轉運體GAT2進行調控。因此，GAT2基因的表達差異可能是引起牡蠣銅富集個體差異的關鍵因素。
　　3.多藥耐藥基因ABCB1在維持牡蠣銅解毒中的作用
　　克隆獲得福建牡蠣ABCB1基因cDNA全長4544 bp，共編碼1370個氨基酸。其結構中有典型的ABC家族保守結構域，與其他雙殼類有較高的同源性。福

6、建牡蠣ABCB1基因主要在鰓和外套膜的表皮柱狀細胞中表達，在銅脅迫下，表達量迅速升高，呈現時間與銅暴露劑量依賴性表達模式。在銅暴露第3d達到表達量高峰，最高濃度銅暴露組牡蠣鰓中表達量與對照組相比可達5.61倍(P＜0.01)。低濃度銅暴露組中隨著暴露時間的增長，該基因表達量逐步恢復到和對照相近水平，但是在高濃度暴露組，其表達量依然顯著高于對照組。將ABCB1基因表達進行抑制后發(fā)現，牡蠣鰓和外套膜中銅的富集水平呈現顯著增加。這些結果表明，

7、牡蠣ABCB1可以將銅作為一種底物進行轉運，推測其在牡蠣維持細胞銅穩(wěn)態(tài)和銅解毒上發(fā)揮著重要作用。
　　4.漆酶(Laccase)在牡蠣銅累積中的作用
　　對漆酶在多種生物基因組中的分布進行統(tǒng)計研究，發(fā)現牡蠣、扇貝的漆酶家族基因與人、昆蟲、腹足類以及其他海洋生物相比，在基因組中有明顯的擴張現象?？寺～@得了福建牡蠣漆酶1類似基因(Lac1-like) CDNA序列，全長2760 bp，開放閱讀框(ORF)編碼蛋白含有796個氨基

8、酸，其中有漆酶家族保守銅離子結合位點。該基因在鰓室頂側表皮細胞與外套膜表皮柱狀細胞中表達量較高。在不同濃度銅暴露實驗中，Lac1-like基因在鰓和外套膜中會被銅脅迫快速激動，表達顯著上調，隨著暴露時間延長，逐漸恢復到和對照組近似水平，呈現時間與銅暴露劑量依賴性變化。在對該基因的表達進行干擾后，發(fā)現牡蠣鰓和外套膜中銅的含量顯著降低，而鎘的富集水平與對照相比沒有顯著變化。以上結果表明，Lac1-like所結合的銅是牡蠣銅富集的重要組成部分

9、，漆酶家族在牡蠣中的擴張與對銅的結合，也部分解釋了牡蠣為何擁有如此強的銅富集能力。
　　5.福建牡蠣銅富集能力遺傳性
　　通過測定，選擇銅富集有顯著差異的牡蠣親本組合產生家系。將后代家系在海上吊養(yǎng)8個月后進行外套膜金屬含量以及整個軟體部銅、鋅、鎘含量測定。發(fā)現家系間存在顯著差異。而銅富集量高的親本組合產生的后代，銅、鋅富集量要高于低富集親本組合所產生的后代，銅的富集平均值在外套膜中甚至高出64.2％。同時，家系間以及個體間銅