重癥肌無力胸腺提取液11KD差異（異常）蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、河南中醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文重癥肌無力胸腺提取液11KD差異（異常）蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究姓名：張建立申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：中醫(yī)外科學(xué)指導(dǎo)教師：曹建西張清勇20080430摘要摘要目的：建立分辨率高和重復(fù)性好的重癥肌無力(myastheniagravis，MG)患者及正常胸腺組織提取液量約11KD差異(異常)蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜，比較二者蛋白質(zhì)組，篩選并鑒定MG胸腺組織異常表達蛋白。方法：1以尿素、硫脲、CHAPS、PMSF為主要成分的

2、樣品裂解液提取10例正常人和37例MG患者增生型胸腺組織蛋白質(zhì)，Bradford法測定蛋白濃度，SDSPAGE電泳篩選含有11KD差異(異常)蛋白帶的MG胸腺組織，并行膠內(nèi)11KD差異(異常)蛋白帶的提取、純化富集，測蛋白濃度后分裝80U凍存。2以17cmpH3—10固相pH梯度膠條(immobilizedpHgradiednt，IPG)做第一向IEF，12％SDS聚丙烯酰胺凝膠為第二向進行雙向電泳(2DE)，PDQuest71軟件分析

3、雙向凝膠電泳圖譜的分辯率和重復(fù)性。3利用PDQuest71軟件，比較MG患者及正常胸腺組織蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜，篩選異常表達蛋白，胰蛋白酶進行膠內(nèi)原位酶解，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassociatedlaserdesorption／ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDITOFMS)分析得到肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemassfingerprinting。PM

4、F)和數(shù)據(jù)。4登陸網(wǎng)站http：／／wwwmatrixsciencetom，用Mascot程序檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫，鑒定蛋白質(zhì)。結(jié)果：1在36例MG增生型胸腺組織標(biāo)本中，應(yīng)用SDSPAGE凝膠進行分離、篩選，其中27例含有11KD差異(異常)蛋白帶，其出現(xiàn)率為75％。研究中為更利于1IKD差異(異常)蛋白帶的篩選，故對12％和15％濃度SDS聚丙烯酰胺凝膠進行比較，實驗發(fā)現(xiàn)采用15％的SDSPAGE凝膠使不同分子量蛋自帶更加集中，尤其

5、是低分子量蛋白，分界清楚，圖像更加清晰，適宜于下一步11KD差異(異常)蛋白的膠內(nèi)富集。2通過雙向電泳，進一步分離了llKD差異(異常)蛋白帶，建立了分辨率高和重復(fù)性好的重癥肌無力(MG)增生型胸腺組織11KD差異蛋白帶的雙向凝膠電泳圖譜，并得到30a：6個蛋白點。3從MG增生型胸腺組織中共篩選出16個異常表達的蛋白點。4異常表達的蛋白點經(jīng)膠內(nèi)酶解質(zhì)譜指紋圖分析，獲得了5張肽質(zhì)量指紋圖譜，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢分析，即Spot4，7，16，19，