盧非酰胺選擇性抑制C纖維介導(dǎo)的傷害性初級(jí)傳入發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用.pdf

1、疼痛（pain）是由傷害性刺激引起的復(fù)雜生理心理活動(dòng)，在正常情況下，是機(jī)體重要的警告信號(hào)，當(dāng)傷害性刺激發(fā)生時(shí)，機(jī)體通過全身皮膚和有關(guān)組織中分布的的傷害性感受器將各種形式的刺激轉(zhuǎn)換成神經(jīng)沖動(dòng)的電活動(dòng)信號(hào)，沿著傳入神經(jīng)，背根神經(jīng)節(jié)到達(dá)脊髓背角或三叉神經(jīng)脊束核中的相關(guān)神經(jīng)元，再由對(duì)側(cè)的腹外側(cè)索傳至丘腦、其他腦區(qū)以及大腦皮質(zhì)，產(chǎn)生痛覺，從而對(duì)有害刺激做出回避反應(yīng)。另一方面，過度的疼痛會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，長(zhǎng)期的劇烈疼痛會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生難以忍受的精神和軀體

2、的折磨，所以減輕異常疼痛，提高人類生活質(zhì)量始終是醫(yī)學(xué)研究的關(guān)注點(diǎn)。介導(dǎo)疼痛的傳導(dǎo)通路及分子作用復(fù)雜，在疼痛機(jī)制的研究長(zhǎng)河中各種學(xué)說層出不窮。其中，作為疼痛四大學(xué)說之一的閘門控制學(xué)說相對(duì)比較確切的闡述了病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制，認(rèn)為在整個(gè)痛覺的傳導(dǎo)過程中，脊髓背角膠狀質(zhì)（Substantia gelatinosa，SG）中的某些神經(jīng)細(xì)胞控制著痛覺信息的傳遞，作用機(jī)理類似閘門的開放，這些神經(jīng)元本身就受粗、細(xì)纖維傳入活動(dòng)和高級(jí)中樞下行控制作用的影

3、響，本學(xué)說的提出為揭示疼痛的發(fā)生機(jī)制開辟了新的方向，基于此理論，我們意識(shí)到，脊髓背角膠狀質(zhì)作為疼痛傳導(dǎo)的中樞起著信息轉(zhuǎn)換的重要作用，必然也是研究開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物的重要靶點(diǎn)。癲癇是因腦部神經(jīng)元異常放電引起的一組臨床綜合征，由已知或未知病因引起，臨床特征表現(xiàn)為反復(fù)、短暫、刻板的神經(jīng)系統(tǒng)功能失常。隨著人類醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)步，新時(shí)期提出的整合醫(yī)學(xué)認(rèn)為將相關(guān)各領(lǐng)域最先進(jìn)的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)加以整合可以形成更加全面的醫(yī)學(xué)知識(shí)體系。隨著人們對(duì)癲癇和疼痛機(jī)制研究

4、的不斷深入，循著整合醫(yī)學(xué)的方向，查閱資料后我們發(fā)現(xiàn)癲癇和疼痛的的發(fā)病機(jī)制部分類似。新型抗癲癇藥物盧非酰胺屬于三唑類衍生物，目前臨床作為輔助治療藥物應(yīng)用于4歲以上兒童和成人Lennox-Gastant綜合征（LGS）相關(guān)癲癇發(fā)作。研究發(fā)現(xiàn)它不僅在癲癇的治療上作用顯著，而且具有潛在的鎮(zhèn)痛作用，與此同時(shí)，它具有穩(wěn)定情緒的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。近年來，盧非酰胺已經(jīng)成功用于癲癇疾病的治療，但是鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不明確，尤其是對(duì)疼痛重要調(diào)節(jié)位點(diǎn)的脊髓背角膠狀質(zhì)神經(jīng)元及

5、其突觸傳遞的作用機(jī)制缺乏有力的研究報(bào)道。
　　本課題主要利用動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試技術(shù)、膜片鉗全細(xì)胞記錄探討盧非酰胺對(duì)脊髓背角SG神經(jīng)元的興奮性以及對(duì)傷害性刺激突觸傳遞的影響，為闡明盧非酰胺的脊髓背角鎮(zhèn)痛機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一：盧非酰胺對(duì)腰5脊神經(jīng)結(jié)扎（Spinal nerve ligation，SNL）神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用
　　目的：觀察抗癲癇藥物盧非酰胺對(duì)腰5脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型（SNL）的

6、機(jī)械、熱痛覺超敏的影響。
　　方法：選取180～220g雄性SD大鼠，于SNL模型制作前3d給予連續(xù)的相同時(shí)間同一環(huán)境適應(yīng)，前1d測(cè)定大鼠疼痛基礎(chǔ)閾值。選取疼痛閾值在正常范圍內(nèi)的大鼠制備腰5脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型。術(shù)后5d同一時(shí)間測(cè)試機(jī)械性縮足反射閾值、熱痛縮足反射潛伏時(shí)間，若疼痛閾值未下降或出現(xiàn)后足偏癱，行為異常視為造模失敗，剔除出組。神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型被隨機(jī)分為三組：（1）大劑量實(shí)驗(yàn)組：將50 mg/k

7、g盧非酰胺溶入1％DMSO中，生理鹽水稀釋至1ml，單次腹腔注射。（2）小劑量實(shí)驗(yàn)組：25 mg/kg盧非酰胺溶入1%DMSO中用生理鹽水稀釋至1ml單次腹腔注射。（3）對(duì)照組：與實(shí)驗(yàn)組等體積、等比例的1%DMSO單次腹腔注射。分別于注射后20 min、40 min、60 min、4 h、12 h、24 h進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估。觀察盧非酰胺對(duì)大鼠L5神經(jīng)損傷后形成的神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果：SNL術(shù)前對(duì)大鼠基礎(chǔ)疼痛閾值進(jìn)行測(cè)定，左、右后

8、足機(jī)械性縮足反射閾值(PWMT)分別為（21.87±5.69）g和（18.33±4.18）g，熱痛縮足反射潛伏時(shí)間(TWL)為（24.43±3.32）s和（22.31±4.28）s，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后第5 d，形成穩(wěn)定神經(jīng)病理性疼痛，與術(shù)前相比，左后足的閾值顯著降低至（6.00±2.13）g（P＜0.001，one-way ANOVA，n=22），熱痛縮足反射潛伏時(shí)間降為（13.45±2.17）s（P＜0.001，one-way ANO

9、VA，n=22），證實(shí)模型建立成功。當(dāng)腹腔注射不同濃度的盧非酰胺后，測(cè)試機(jī)械、熱痛閾值發(fā)現(xiàn)兩種濃度的盧非酰胺均可以顯著緩解已形成的慢性疼痛，并且鎮(zhèn)痛作用具有明顯的濃度依賴性，并在給藥后1h作用達(dá)到高峰，與溶劑組相比可顯著提升大鼠術(shù)側(cè)機(jī)械性縮足反射閾值至（19.99±7.17）g和（17.00±7.32）g（P<0.001，one-way ANOVA，n=8），增加熱痛縮足反射潛伏時(shí)間至（16.23±3.14） s和（19.90±2.41

10、）s（P<0.001，one-way ANOVA，n=8）這一作用可維持至注藥后12 h。
　　實(shí)驗(yàn)二：盧非酰胺對(duì)脊髓背角膠狀質(zhì)（SG）神經(jīng)元興奮性的影響
　　目的：應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，在脊髓矢狀位切片上觀察盧非酰胺對(duì)SG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢唬ˋction potential，AP）發(fā)放頻率的影響。
　　方法：取4～5周齡雄性SD大鼠，制備厚度為400-500μm帶后根的脊髓腰骶膨大段矢狀位切片。低倍鏡下確定脊髓背角淺

11、層，高倍鏡下選擇狀態(tài)較好的SG神經(jīng)元做全細(xì)胞記錄，鉗制電流為0 pA，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定5 min后。觀察盧非酰胺對(duì)SG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率的影響。
　　結(jié)果：抗癲癇藥物盧非酰胺可顯著減少脊髓背角 SG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率（P<0.01，paired t-test），給予一段時(shí)間洗脫，盧非酰胺的抑制作用被成功逆轉(zhuǎn)（P<0.01，paired t-test）。
　　實(shí)驗(yàn)三：盧非酰胺對(duì)傷害性感覺通路突觸傳遞的選擇性抑制作用

12、r>　　目的：全細(xì)胞記錄，電壓鉗模式下給予后根刺激，觀察抗癲癇藥物盧非酰胺對(duì)中等直徑 Aδ纖維和小直徑 C纖維介導(dǎo)的脊髓背角 SG神經(jīng)元的興奮性突觸后電流（eEPSCs）及自發(fā)性興奮性突觸后電流（sEPSCs）的影響。
　　方法：同實(shí)驗(yàn)二，制備SD大鼠脊髓切片，選取SG神經(jīng)元，鉗制電壓為-70 mV,給予從小到大的后根恒壓電刺激，先記錄給藥前誘發(fā)的興奮性突觸后電流（eEPSCs）15條曲線，平均后作為對(duì)照，浴槽內(nèi)不間斷灌流200μ

13、M盧非酰胺1 min后相同方法再次記錄，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道不同的纖維傳導(dǎo)具有的電生理特異性，對(duì)記錄的細(xì)胞進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。（1）觀察盧非酰胺對(duì)Aδ纖維介導(dǎo)的eEPSCs的作用。（2）觀察盧非酰胺對(duì)C纖維介導(dǎo)的eEPSCs的作用（。3）觀察盧非酰胺對(duì)脊髓背角SG神經(jīng)元sEPSCs的影響。
　　結(jié)果：（1）單次灌流不同濃度的盧非酰胺對(duì)Aδ纖維介導(dǎo)的eEPSCs幾乎不產(chǎn)生影響（P＞0.05，paired t-test）。（2）盧非酰胺可顯著抑制C

14、纖維介導(dǎo)的eEPSCs的峰值（P<0.01，paired t-test）。（3）盧非酰胺灌流可以明顯抑制SG神經(jīng)元sEPSCs的發(fā)放頻率（P<0.001，paired t-test），但對(duì)其幅度沒有明顯影響（P＞0.05，paired t-test）。
　　結(jié)論：
　　1.單次腹腔注射不同濃度的盧非酰胺均可以有效緩解已形成的慢性疼痛，鎮(zhèn)痛作用在給藥后1h達(dá)到高峰且具有濃度依賴性。
　　2.盧非酰胺可以顯著抑制脊髓背角