基于脂質(zhì)體超濾技術(shù)的板藍(lán)根活性成分研究.pdf

1、目的：優(yōu)化建立最佳板藍(lán)根脂質(zhì)體制備工藝，運用脂質(zhì)體沉淀超濾離心的方法，結(jié)合HPLC以及LC-ESI-MS技術(shù)，篩選出板藍(lán)根提取液中能夠被脂質(zhì)體吸收的成分；并在體外建立模擬胃腸道微環(huán)境，推斷這些成分是否受胃腸道酸堿環(huán)境的影響以及主要的代謝過程，最終確定板藍(lán)根中合理的活性成分；研究板藍(lán)根中合理的活性成分在 Caco-2細(xì)胞模型的吸收、轉(zhuǎn)運特性及其機制。
　　方法:（1）采用薄膜分散法，以膽固醇、大豆卵磷脂為載體，通過正交試驗考察了大豆

2、卵磷脂與膽固醇的用量比、水化的時間、水合介質(zhì)用量和水合介質(zhì)pH值對制備工藝的影響。以脂質(zhì)體的包封率為評價指標(biāo)，以板藍(lán)根中的胞苷、腺苷為檢測指標(biāo)，采用HPLC進(jìn)行含量測定，最終確定最佳制備工藝。（2）運用最佳的板藍(lán)根脂質(zhì)體的制備工藝，借助HPLC-MS手段，進(jìn)一步研究能夠被脂質(zhì)體包裹的、具有生物膜活性的大分子物質(zhì)。（3）以已在板藍(lán)根脂質(zhì)體中檢測到的精氨酸、胞苷、尿苷、表高依春、腺苷為研究對象，運用沉淀離心-超濾技術(shù)，借助HPLC聯(lián)合LC-

3、ESI-MS分析比對，在模擬的胃腸道環(huán)境下（pH1.0~8.0），考察這些成分是否受酶的影響、受何種酶的影響、以及是否有代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。最終確定合理的板藍(lán)根活性成分。（4）建立 Caco-2細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)運模型，采用MTT法考察受試化合物對Caco-2細(xì)胞的安全性，選擇跨膜電阻值、堿性磷酸酶和熒光素鈉通透性3個指標(biāo)對所建立的模型進(jìn)行檢驗?？疾鞚舛取r間、溫度、pH值及抑制劑對受試化合物吸收的影響，采用HPLC法檢測受試化合物的濃度，測定受

4、試化合物從AP側(cè)→BL側(cè)和BL側(cè)→AP側(cè)轉(zhuǎn)運量，計算其在不同側(cè)的表觀滲透系數(shù)（Papp（AP-BL）、Papp（BL-AP））和外排率ER（ER=Papp（BL-AP）/Papp（AP-BL））
　　結(jié)果：（1）確定最佳制備工藝條件為：大豆卵磷脂與膽固醇的比例為6:1，水化時間為25 min，PBS磷酸鹽緩沖溶液的用量為10 mL，水化介質(zhì)的pH值為6.86。胞苷和腺苷分別在10.27~500.3μg·mL-1（r=0.9998，

5、n=6）和10.36~493.6μg·mL-1（r=0.9997，n=6）范圍內(nèi)呈線性關(guān)系良好；精密度、回收率、穩(wěn)定性均良好。（2）進(jìn)一步分析研究，最終在板藍(lán)根脂質(zhì)體中檢測到能夠被脂質(zhì)體包裹的、具有生物膜活性的五種成分：精氨酸、胞苷、尿苷、表高依春、腺苷。（3）通過LC-MS檢測結(jié)果可知，板藍(lán)根中主要成分的對照品，除了表高依春外，精氨酸、胞苷、腺苷均受人工胃腸道環(huán)境的影響；在模擬不同酸堿度的胃腸道微環(huán)境下，經(jīng)過HPLC分析結(jié)果可知，板藍(lán)

6、根藥液中的成分精氨酸、胞苷主要受胃腸道環(huán)境下胰蛋白酶的影響，腺苷主要受胃腸道環(huán)境下胃蛋白酶的影響；最后通過LC-MS技術(shù)最終確定，精氨酸受胰蛋白酶的影響，代謝產(chǎn)生了鳥氨酸；腺苷受胃蛋白酶影響，代謝產(chǎn)生了腺嘌呤?？梢猿醪酱_定板藍(lán)根中的精氨酸、腺苷為活性成分。（4）用于轉(zhuǎn)運實驗的Caco-2細(xì)胞經(jīng)過21天培養(yǎng)分化后，在形態(tài)上與小腸上皮細(xì)胞相似；熒光素通透量小于0.5％/h，跨膜電阻大于200Ω·cm2，細(xì)胞產(chǎn)生極性分化，形成均勻的細(xì)胞單層，

7、且其致密性、完整性及功能性均良好。Caco-2細(xì)胞對板藍(lán)根中的成分精氨酸、腺苷的吸收在60 min內(nèi)呈線性關(guān)系，藥物的攝取時間為60 min；隨著溫度的升高，板藍(lán)根成分中的精氨酸、腺苷的攝取量均降低；板藍(lán)根中的精氨酸成分的攝取量最大，但隨著pH的升高，精氨酸成分的攝取量在降低；而板藍(lán)根中的腺苷成分隨pH升高攝取量升高；P-gp抑制劑維拉帕米可顯著增加Caco-2細(xì)胞對板藍(lán)根中的精氨酸、腺苷的吸收（P<0.05）。精氨酸和腺苷雙向轉(zhuǎn)運的表

8、觀滲透性良好，外排率ER均大于1.5，且存在方向差異。
　　結(jié)論：本實驗借助于超濾沉淀技術(shù)，聯(lián)用HPLC、LC-ESI-MS分析手段，初步篩選出板藍(lán)根中能夠被脂質(zhì)體包裹的、具有生物膜活性的五種成分：精氨酸、胞苷、尿苷、表高依春、腺苷；再通過體外模擬胃腸道微環(huán)境的代謝情況和Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運模型，最終快速、準(zhǔn)確地篩選并鑒定出板藍(lán)根成分中的精氨酸、腺苷為合理有效的活性成分。與藥效成分常規(guī)篩選方法相比，超濾質(zhì)譜技術(shù)作為中藥活性成分初篩