代謝綜合癥及其相關(guān)性疾病心血管損害的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、背景 代謝綜合征(Metabolic syndrome，MS)是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。MS是指包括腹型肥胖、糖耐量異常、胰島素抵抗、血脂異常及高血壓等一組心血管疾病危險(xiǎn)因素的癥候群。MS的總體危險(xiǎn)性并非其各組分的危險(xiǎn)性簡(jiǎn)單相加，而可能是存在相互增強(qiáng)的作用。更好地理解MS的意義在于能幫助我們?cè)缙诎l(fā)現(xiàn)2型糖尿病及心血管疾病高?；颊?。 臨床研究表明，MS患者動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)生率明顯增高，即使在年輕人群中，MS依然是動(dòng)脈粥

2、樣硬化的危險(xiǎn)因素。上述研究提示，血管結(jié)構(gòu)和功能異常可能是MS患者心血管疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。而關(guān)于MS大血管結(jié)構(gòu)與功能的改變尚缺乏系統(tǒng)的研究。 與正常人相比，MS患者血C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-18(IL-18)等炎癥因子水平升高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MS大鼠血CRP水平升高，腎臟組織IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA.表達(dá)增加。這些研究結(jié)果提示可能炎癥在M

3、S的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但上述研究結(jié)果尚不足以幫助我們區(qū)分究竟炎癥是MS的“標(biāo)記物”還是“危險(xiǎn)因素”。 IL-18是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的重要炎癥介質(zhì)，IL-18在心血管疾病中的作用愈來(lái)愈受到重視。臨床研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性及不穩(wěn)定性心絞痛患者頸動(dòng)脈粥樣斑塊IL-18及IL-18受體表達(dá)上調(diào)，且IL-18mRNA表達(dá)與斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)。IL-18能使ApoE基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化加重，而IL-18基因敲除能減輕小鼠動(dòng)脈粥樣硬化程度

4、。肥胖者血IL-18水平升高；在MS人群的研究發(fā)現(xiàn)IL-18是代謝綜合征的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上述研究提示IL-18可能在MS特別是在MS大血管結(jié)構(gòu)與功能改變中發(fā)揮著重要作用。 因此，我們假設(shè)大血管結(jié)構(gòu)與功能異常，特別是血管炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可能是MS患者心血管并發(fā)癥的主要病理生理基礎(chǔ)；炎癥因子IL-18促進(jìn)MS的發(fā)展，特別是能加重MS大血管炎癥反應(yīng)。本研究將對(duì)炎癥是MS的“標(biāo)記物”還是“危險(xiǎn)因素”加以探討，為更好的理解MS的發(fā)病機(jī)制提供理

5、論依據(jù)。 目的:1.觀察MS大鼠是否存在主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)異常及血管炎癥反應(yīng)； 2.明確IL-18能否促進(jìn)MS的發(fā)展，特別是能否加重MS血管炎癥反應(yīng)； 3.探討IL-18在MS血管炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制。 方法: 1.IL-18基因克隆及腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)Genebank大鼠IL-18基因序列，設(shè)計(jì)引物，提取大鼠脾臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR.)擴(kuò)增IL-18基因?；厥漳康幕虿喛寺≈罷載體

6、，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，應(yīng)用Ad-Easy腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)，構(gòu)建含大鼠IL-18基因的腺病毒質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)染293.T細(xì)胞行病毒包裝、擴(kuò)增及純化，得到大鼠IL-18腺病毒載體。 2.代謝綜合征大血管病變及IL-18在血管炎癥反應(yīng)中機(jī)制的研究雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組(12只)，MS組(38只)。對(duì)照組以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，并給予普通飲水；MS組以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，同時(shí)給予10％的高果糖飲水。喂養(yǎng)32周后再將MS組大鼠分為

7、三組：MS組(9只)，繼續(xù)給予高果糖飲水；空載體組(n=9只)，繼續(xù)給予高果糖飲水的同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射1×1010pfu含GFP腺病毒載體(溶于400ul無(wú)菌PBS)；IL-18載體組(n=13只)，繼續(xù)給予高果糖飲水的同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射1×1010pfu IL-18腺病毒載體(溶于400ul無(wú)菌PBS)；對(duì)照組及MS組給予等體積的無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)尾靜脈注射。轉(zhuǎn)染腺病毒載體后6周，處死動(dòng)物，留取血管標(biāo)本備用。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

8、進(jìn)行下述指標(biāo)的測(cè)定：(1)所有大鼠開始果糖喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)32周及轉(zhuǎn)染載體后6周，抽取頸靜脈竇血2ml，分離血清，常規(guī)法測(cè)定血脂、血糖、血胰島素；(2)轉(zhuǎn)染IL-18腺病毒載體后1、2、3、4、6周抽取各組大鼠頸靜脈竇血2ml，分離血清，ELISA法測(cè)定血幾.18水平；(3)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有大鼠每?jī)芍軠y(cè)量體重及尾動(dòng)脈血壓一次；(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，所有大鼠均經(jīng)頸動(dòng)脈插管行心導(dǎo)管檢查，測(cè)量收縮壓及舒張壓。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，留取血管

9、標(biāo)本，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：(1)主動(dòng)脈病理學(xué)檢測(cè)；(2)Verhoeff彈力纖維染色；(3)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)IL-18、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)：(4)免疫組織化學(xué)檢測(cè)主動(dòng)脈IL-18、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)，并檢測(cè)主動(dòng)脈壁巨噬細(xì)胞含量；(5)Western Blot檢測(cè)主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1、IRAK1蛋白含量；(6)EMSA法測(cè)定主動(dòng)脈組織NF-κB活性。 結(jié)果: 1.IL-1

10、8基因克隆及腺病毒載體構(gòu)建我們根據(jù)大鼠IL-18基因序列，自行設(shè)計(jì)引物，成功克隆出了大鼠IL-18基因。經(jīng)測(cè)序分析與已知大鼠IL-18序列完全相符。利用Ad-Easy腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)，成功構(gòu)建了含大鼠IL-18基因的腺病毒載體(Ad-IL-18)。同時(shí)構(gòu)建了不含目的基因的空載體(Ad-GFP)。 2.代謝綜合征大血管病變及IL-18在血管炎癥反應(yīng)中機(jī)制的研究2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有7只大鼠死亡，均為代謝綜合征組大鼠

11、，正常對(duì)照組無(wú)大鼠死亡。共43只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，其中對(duì)照組12只，MS組9只；空載體組9只；IL-18腺病毒載體組13只。 2.2高果糖喂養(yǎng)32周兩組大鼠代謝指標(biāo)比較高果糖喂養(yǎng)前，兩組大鼠體重、尾動(dòng)脈收縮壓、血糖、血脂、空腹胰島素等均無(wú)差異。高果糖喂養(yǎng)32周后，與對(duì)照組比較，MS組大鼠體重、尾動(dòng)脈收縮壓、血甘油三酯、血胰島素及HOMA升高，差異有顯著性意義(P＜0.01～0.0001)；而兩組大鼠血糖及血總膽固醇無(wú)顯著差異。表明經(jīng)

12、32周高果糖喂養(yǎng)，已成功建立了大鼠MS模型。 2.3 IL-18腺病毒載體轉(zhuǎn)染后大鼠血IL-18水平變化轉(zhuǎn)染前MS各組大鼠血IL-18水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL- 8腺病毒轉(zhuǎn)染后1周，IL-18載體組大鼠血清IL-18顯著升高，轉(zhuǎn)染后2周達(dá)到最高水平，約為空載體組IL-18水平的4倍(256.53±25.32 vs.60.93±6.57 pg/ml，P＜0.0001)，于轉(zhuǎn)染后3周開始降低，但仍高于空載體組IL

13、-18水平(153.17±29.41vs.59.67±8.57 pg/ml，P＜0.0001)，4周時(shí)與空載體組IL-1 8水平相當(dāng)(64.40±2.93vs.56.62±8.46 pg/ml，P=0.070)。 2.4 IL-18對(duì)大鼠代謝指標(biāo)的影響轉(zhuǎn)染IL-18腺病毒載體后6周，與空載體組比較，IL-18載體組血胰島素水平及HOMA升高，差異有顯著性意義(P＜0.001及P＜0.05)；兩組間其余指標(biāo)比較無(wú)顯著差異。

14、 與轉(zhuǎn)染前比較，IL-18載體組血胰島素水平及HOMA升高，差異有顯著性意義(P＜0.001及P＜0.05)；與轉(zhuǎn)染前比較其余指標(biāo)無(wú)顯著差異。 2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠有創(chuàng)血壓比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)有創(chuàng)血壓結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，MS組、空載體組、IL-18載體組SBP、DBP均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而脈壓在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與MS組及空載體組比較，IL-18載體組SBP、DBP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.6 各組大鼠

15、主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)及超微結(jié)構(gòu)比較HE染色顯示，光鏡觀察正常對(duì)照組、MS組及空載體組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜平坦，內(nèi)皮細(xì)胞扁平、完整，緊貼于平滑的內(nèi)彈力板上。IL-18載體組大鼠血管表面欠光滑，可見內(nèi)皮細(xì)胞層斷裂現(xiàn)象。 與對(duì)照組相比，MS組大鼠主動(dòng)脈血管管壁面積(MCSA)、中膜厚度(Mt)、管壁管腔比值(WLR)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)；而血管管腔面積(LCSA)、外彈力板面積(ECSA)、血管管腔直徑(Ld)、

16、血管直徑(Vd)等指標(biāo)無(wú)顯著性差異。 與空載體組比較，IL-18載體組大鼠Le、Mt、WLR增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01～0.001)；與MS組比較，IL-18載體組大鼠Mt、WLR增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(.P＜0.01～0.001)；與對(duì)照組比較，IL-18載體組大鼠MCSA、Le、Mt、WLR增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)；而其他指標(biāo)差異無(wú)顯著性意義。 結(jié)論: 1.我們成功構(gòu)建了大

17、鼠IL-18腺病毒載體，為更好的研究IL-18在心血管疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。 2.通過(guò)給予Wistar大鼠10％的高果糖飲水32周，能成功建立與人MS較為相似的MS大鼠模型。 3.MS大鼠存在主動(dòng)脈肥厚性重構(gòu)，MS大鼠主動(dòng)脈炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，所有這些異常可能構(gòu)成了MS心血管并發(fā)癥高發(fā)的基礎(chǔ)。 4.IL-18能使MS大鼠血胰島素水平升高，胰島素抵抗加重。 5.IL-18通過(guò)IRAK-1/NF-kB通路加重MS大鼠血管