新型陽離子高分子基因載體系統(tǒng)的構(gòu)建與評價.pdf

1、基因治療已經(jīng)開始用于腫瘤、癌癥及各種遺傳性疾病的治療當(dāng)中，臨床效果較傳統(tǒng)治療顯著，且應(yīng)用前景廣闊。而要實現(xiàn)高效的基因治療，設(shè)計高效低毒的基因載體是其中一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)?；蜉d體包括病毒類載體、非病毒類載體，相對于病毒載體，非病毒載體尤其是陽離子非病毒載體具有低細(xì)胞毒性、低免疫性、易合成等特點，已成為目前的研究熱點。
　　殼聚糖作為天然的多糖，具有無毒，可降解，生物相容性好，且分子中含有大量的氨基，能與質(zhì)粒DNA復(fù)合形成納米粒，已有大

2、量報道將其作為基因載體應(yīng)用于基因治療。但是殼聚糖水溶性差，與DNA復(fù)合緊密而難于在體內(nèi)釋放DNA，轉(zhuǎn)染效率較低，臨床應(yīng)用受到限制。因此，尋找適合的途徑得到新型陽離子殼聚糖衍生物來作為基因載體，提高它的轉(zhuǎn)染效率，是研究者努力的方向。本論文實驗第一部分利用邁克爾加成反應(yīng)合成了一系列新型水溶性殼聚糖衍生物。用核磁共振氫譜對載體材料進行化學(xué)表征，以確定其結(jié)構(gòu)。用凝膠電泳實驗觀察殼聚糖衍生物與質(zhì)粒DNA的結(jié)合能力，用電子掃描電鏡來觀察粒子的形狀大

3、小，測定粒子粒徑及電動電勢，用MTT法檢測復(fù)合體的細(xì)胞毒性，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)來測定殼聚糖衍生物的轉(zhuǎn)染效率。實驗結(jié)果表明，與殼聚糖相比，新型殼聚糖衍生物具有較低的細(xì)胞毒性，較好的DNA復(fù)合能力，在293 T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中有更高的轉(zhuǎn)染效率。
　　基于二硫鍵對不同濃度的谷胱甘肽濃度有特異響應(yīng)性，并且細(xì)胞中的谷胱甘肽濃度高于血液中的谷胱甘肽濃度，癌細(xì)胞中的谷胱甘肽濃度約為正常細(xì)胞內(nèi)的四倍，本論文實驗第二部分我們以透明質(zhì)酸為骨架，引入

4、二硫鍵，后接枝四乙烯五胺制備出一種基于透明質(zhì)酸的陽離子高分子載體，用紅外、核磁共振氫譜(1H NMR)對載體材料進行結(jié)構(gòu)表征。通過與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物，并用瓊脂糖凝膠電泳分析其結(jié)合 DNA的能力及在高濃度谷胱甘肽刺激下釋放 DNA的能力；測定復(fù)合粒子的粒徑、電勢，并在掃描電子顯微鏡下觀察復(fù)合物的形態(tài)；用MTT法檢測復(fù)合體的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，新合成的透明質(zhì)酸陽離子衍生物易與 DNA復(fù)合，并在模擬細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽刺激下釋放 DNA，