柑橘褐斑病菌SNF1和FTR1基因生物學(xué)功能初步研究.pdf

1、由交鏈格孢菌(Alternaria alternata)引起的柑橘褐斑病主要為害感病品種的葉片、枝梢、花瓣和果實(shí)，嚴(yán)重時造成葉片和果實(shí)大量脫落，導(dǎo)致柑橘減產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)柑橘褐斑病菌產(chǎn)生的ACT毒素及對活性氧的解毒機(jī)制是其侵染寄主致病所必需的，但當(dāng)前對于毒素合成機(jī)制及解毒活性氧的分子機(jī)理仍缺乏深入的系統(tǒng)研究，同時對病原菌基礎(chǔ)代謝相關(guān)研究開展尚不充分。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶SNF1在多種植物病原真菌中被證實(shí)參與對生長發(fā)育及致病性的調(diào)控，且轉(zhuǎn)錄組測

2、序結(jié)果顯示H2O2可誘導(dǎo)柑橘褐斑病菌AaSNF1基因的表達(dá)。高親和鐵離子通透酶FTR1參與真菌胞內(nèi)鐵代謝，研究人員推測柑橘褐斑病菌可能存在一套由還原性鐵離子攝取系統(tǒng)參與的對活性氧的解毒。因此，為進(jìn)一步了解柑橘褐斑病菌致病機(jī)理，本研究聚焦柑橘褐斑病菌SNF1和FTR1基因，初步分析其在生長致病過程中發(fā)揮的作用。
　　本試驗(yàn)優(yōu)化柑橘褐斑病菌原生質(zhì)體制備條件，初步完善PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系。同時通過基因敲除及回補(bǔ)，初步分析SN

3、F1和FTR1在柑橘褐斑病菌生長發(fā)育及致病過程中的作用，得到如下結(jié)果：
　　1.柑橘褐斑病菌在PDB中150 rpm培養(yǎng)36 h，以0.7 M NaCl為穩(wěn)滲劑，1%Kitalase于30℃酶解2.5 h時所釋放原生質(zhì)體數(shù)量最多，達(dá)4.36×108個/mL，可滿足轉(zhuǎn)化需要。以柑橘褐斑病菌不同基因轉(zhuǎn)化該方法制備的原生質(zhì)體，在抗性平板上均能收獲足量的轉(zhuǎn)化子，表明該優(yōu)化方法達(dá)到預(yù)期效果。
　　2.應(yīng)用Split-marker方法構(gòu)

4、建AaSNF1、AaFTR1基因敲除盒，利用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗生素篩選、PCR及Souhern雜交驗(yàn)證得到AaSNF1和AaFTR1基因敲除菌株。利用酵母高效同源重組原理構(gòu)建基因回補(bǔ)載體，遺傳轉(zhuǎn)化后得到回補(bǔ)菌株CP-S-2和CP-F-2。
　　3.野生型與突變體表型分析結(jié)果顯示：AaSNF1基因參與調(diào)控柑橘褐斑病菌的菌絲生長、產(chǎn)孢、碳源利用、細(xì)胞壁功能及致病性。具體結(jié)果如下：(1)ΔAaSnf1菌株氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌

5、落顏色變深，在不同培養(yǎng)基上生長速度下降，PDA培養(yǎng)基上菌落直徑減小19%。(2)與野生型相比，ΔAaSnf1突變體產(chǎn)孢量下降70%，分生孢子顏色變淺，直徑變小。PDB培養(yǎng)基中，突變體孢子萌發(fā)延滯明顯，野生型在接種2 h時萌發(fā)率為30%左右，而突變體僅有5%的孢子正常萌發(fā)。直至8 h時，野生型已有90%以上的孢子萌發(fā)，而ΔAaSnf1突變體萌發(fā)率僅50%左右。野生型在接種12 h時孢子基本全部萌發(fā)，變體菌株萌發(fā)率上升至80%。(3) Aa

6、SNF1的缺失導(dǎo)致菌株致病力顯著下降，突變體無病斑或僅形成小斑。在多聚半乳糖醛酸、蔗糖、酒精為單一碳源的培養(yǎng)上，ΔAaSnf1突變體出現(xiàn)生長缺陷，菌落直徑比野生型分別下降35%、37%和45%。(4)相比于野生型，ΔAaSnf1突變體在含細(xì)胞壁脅迫因子的培養(yǎng)基上表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，并且隨脅迫因子濃度的升高表現(xiàn)更為顯著。但ΔAaSnf1突變體在含不同穩(wěn)滲劑及H2O2的培養(yǎng)基上與野生型生長無明顯差異。回補(bǔ)菌株CP-S-2生長致病恢復(fù)至野生型

7、水平。
　　4. AaFTR1在低鐵環(huán)境下被誘導(dǎo)表達(dá)，相對表達(dá)量為對照組的32倍。AaFTR1的缺失導(dǎo)致柑橘褐斑病菌胞內(nèi)鐵含量顯著下降，且低鐵環(huán)境下降更明顯。但突變體表型分析結(jié)果顯示AaFTR1基因的缺失并不影響菌株的生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)、滲透壓脅迫、氧化脅迫及致病性。雖然突變體致病力與野生型無差異，但RT-qPCR分析表明，AaFTR1基因在侵染柑橘致病的過程中表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的先上升后下降趨勢，在侵染初期(接種48 h)達(dá)到峰