抗SMP30-CNN2抗體的血清學(xué)分析及其聯(lián)合檢測HCC的研究.pdf

1、目的：通過基因工程菌大量表達(dá)純化兩種可溶性肝細(xì)胞癌相關(guān)抗原SM P30、CNN2，并分別以這兩種基因工程蛋白作為抗原檢測肝細(xì)胞癌、肝炎肝硬化等肝病患者及正常人血清中相應(yīng)抗體的表達(dá)情況，探討血清中這兩種抗體聯(lián)合AFP檢測原發(fā)性肝癌的輔助價值。
　　方法：活化基因工程菌E.Coli.BL21后，涂布于LB-Kan+培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于LB-Kan+培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜，保存菌種，并按1:100接種于新的LB-K

2、an+培養(yǎng)基中大體積培養(yǎng)2.5小時，之后加入IPTG誘導(dǎo)劑，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5小時。菌體經(jīng)超聲破菌離心后,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。取上清過Ni-NTA親和層析柱，以不同濃度的咪唑洗脫液對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化洗脫，超濾管超濾濃縮洗脫液，純化濃縮后的蛋白用SDS-PAGE方法進(jìn)行分析鑒定。分別用重組表達(dá)的兩種蛋白包被酶標(biāo)板，間接EL ISA方法檢測原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者（HCC）、肝炎肝硬化患者和正常人血清中相應(yīng)抗體存在的情況，結(jié)

3、合各項(xiàng)臨床指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)合數(shù)據(jù)對肝炎肝硬化組陽性樣本和部分陰性樣本進(jìn)行電話隨訪，分析與肝癌預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：取加入IPTG誘導(dǎo)劑前后菌液，破碎離心，取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在目的蛋白條帶附近，誘導(dǎo)之前與誘導(dǎo)后存在較大差異，其中誘導(dǎo)后的菌液上清和沉淀在目的蛋白附近均出現(xiàn)大量條帶，而誘導(dǎo)前的菌液中則很少。分析認(rèn)為，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，基因工程菌E.Coli.BL21表達(dá)出大量目的蛋白，并且有一部分為可溶

4、性蛋白。與之前課題組表達(dá)純化的蛋白較為一致。取上清過柱純化，經(jīng)超濾管超濾后得到的濃縮蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，得到較為單一的目的蛋白條帶，經(jīng)ImageJ軟件分析，SMP30蛋白純度為94.13％，CNN2蛋白純度為81.7%。分別以上述兩種蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，間接ELISA分析得知，抗SMP30抗體對HCC組的陽性檢出率為25.87%，對肝炎肝硬化組的陽性檢出率為4.25%，正常人組則未檢出陽性樣本?？笴NN2抗體對HCC組的陽

5、性檢出率為21.3%，對肝炎肝硬化組的陽性檢出率為9.9%。對正常人組的陽性檢出率為1.2%。采用受試者工作特征曲線(ROC)分析，抗SMP30抗體診斷HCC組，ROC曲線下面積為0.824，靈敏度25.87%，特異度97.45%?？笴NN2抗體診斷HCC組ROC曲線下面積為0.73，靈敏度為21.14%，特異度為94.30%。兩種蛋白經(jīng)pearson Chi-Square雙側(cè)檢測法對HCC組患者血清抗體與臨床各項(xiàng)指標(biāo)如年齡、性別、病理

6、分級、AFP值、肝硬化與否、HBVe抗原、HBVe抗體、DNA拷貝數(shù)、乙肝表面抗原、乙肝表面抗體、ALT和AST值、腫瘤大小等等關(guān)系進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，各組的P值均大于0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即還不能確定陽性血清與臨床資料有關(guān)系。兩種血清抗體聯(lián)合AFP檢測HCC血清，陽性檢出率為73.98%，明顯高于單一檢測，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合檢測有助于提高原發(fā)性肝癌的診斷率，減少漏診。通過對肝炎肝硬化組陽性樣本和部

7、分陰性樣本進(jìn)行電話隨訪，暫未發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生。尚無法確定肝癌發(fā)生與這兩種相關(guān)抗原之間的關(guān)系。
　　結(jié)論：1.我們的研究顯示HCC患者血清中抗SMP30/CNN2抗體陽性率明顯要高于肝炎肝硬化病人和正常人，對HCC的檢測具有輔助診斷價值。
　　2.抗SMP30/CNN2抗體聯(lián)合AFP共同檢測HCC血清抗體陽性率高于單一檢測陽性率，有助于提高原發(fā)性肝癌的診斷率，減少漏診。
　　3.電話隨訪結(jié)果顯示暫不能確定SMP30與CNN2