抗抗生素類藥物抗體的檢測(cè)與研究和稀有血型分子生物學(xué)篩查.pdf

1、在臨床治療過(guò)程中使用藥物，特別是使用抗菌素類藥物時(shí)，機(jī)身除了會(huì)產(chǎn)生藥物耐受之外，還有可能產(chǎn)生針對(duì)此種藥物的抗藥物抗體。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生抗藥物抗體之后，藥物、抗藥物抗體及紅細(xì)胞會(huì)形成一種免疫復(fù)合物，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)紅細(xì)胞的破壞清除，引起免疫溶血性貧血、藥物使用無(wú)效以致危及患者生命安全。雖然產(chǎn)生抗藥物抗體的幾率很低，但至今為止已報(bào)道有超過(guò)100種藥物可以引發(fā)抗藥物抗體的產(chǎn)生。隨著科技的進(jìn)步及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的藥物會(huì)投入使用。因此，建立一種有效的

2、檢測(cè)抗藥物抗體的方法，對(duì)藥物引發(fā)的免疫溶血性貧血的檢測(cè)，病因的確定，指導(dǎo)用藥等方面都有著重要的意義。使用藥物、紅細(xì)胞與患者的血漿及紅細(xì)胞放散液進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，一直作為經(jīng)典的檢測(cè)血液中抗藥物抗體的方法。但使用藥物包被的紅細(xì)胞并不能充分的說(shuō)明患者體內(nèi)的抗藥物抗體究竟是針對(duì)于藥物與紅細(xì)胞膜的復(fù)合結(jié)構(gòu)，還是針對(duì)于藥物修飾作用以后的紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，所以，弄清藥物引發(fā)抗藥物抗體產(chǎn)生的機(jī)制，對(duì)于定義抗藥物抗體的類型有著深遠(yuǎn)的意義。
　　 本研究

3、中選取了目前上海市各大臨床醫(yī)院使用頻率靠前的青霉素、阿奇霉素、左氧沙星、頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢他啶與頭孢克洛9種抗生素類藥物，在特殊的緩沖體系下，構(gòu)建了藥物包被的RBC。使用藥物包被的RBC對(duì)樣本進(jìn)行抗藥物抗體的檢測(cè)，主要針對(duì)半抗原機(jī)制的抗藥物抗體與藥物作用于RBC膜后引發(fā)的新的自身抗體。對(duì)181例樣本（在上海市血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行疑難配血的樣本61例，進(jìn)行Coombs’試驗(yàn)與抗體篩查的樣本51例以及在瑞金醫(yī)

4、院進(jìn)行骨髓移植的樣本70例）進(jìn)行檢測(cè)。使用熒光素標(biāo)記的抗體，對(duì)頭孢菌素處理的RBC進(jìn)行CD55與CD59的改變情況進(jìn)行檢測(cè)。并以青霉素為代表藥物，使用Far-Western-Blotting的方法，對(duì)藥物與RBC膜蛋白的作用進(jìn)行研究。
　　 通過(guò)血清學(xué)方法，使用藥物包被的RBC檢測(cè)181例樣本，在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在疑難配血的61個(gè)樣本中，發(fā)現(xiàn)含有特異性抗青霉素抗體的樣本4例(6.56％)，特異性抗頭孢菌素類藥物抗體1(0.16％)例，

5、非特異性抗藥物抗體2(0.33％)例；在抗體篩查與Coombs’試驗(yàn)的50個(gè)樣本中，發(fā)現(xiàn)含有特異性抗青霉素抗體的樣本4(8％)例；在進(jìn)行骨髓移植的70個(gè)樣本中，發(fā)現(xiàn)含有特異性抗青霉素抗體的樣本1(1.43％)例；針對(duì)藥物來(lái)說(shuō)，在全部181個(gè)樣本中，產(chǎn)生的針對(duì)青霉素類藥物的抗體是最多的，為9例(4.97％)，產(chǎn)生了針對(duì)頭孢菌素類藥物抗體l例(0.55％)，而非特異性抗藥物抗體為2例(1.1％)。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，使用頭孢菌素處理的RBC膜

6、上CD55與CD59的含量均有下降。Far-Western-Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示與青霉素作用的RBC膜蛋白分子量在130KD以上。
　　 機(jī)體只有很低的概率會(huì)產(chǎn)生抗藥物抗體，青霉素與RBC膜蛋白作用的結(jié)果提示藥物可能作用于血型蛋白上。藥物會(huì)與哪些RBC膜蛋白進(jìn)行結(jié)合仍不得知。
　　 本論文另一項(xiàng)研究是分析中國(guó)人群中CO、YT、LU、K、DI五種稀有血型等位基因的頻率。人體的紅細(xì)胞上有約300種抗原物質(zhì)，屬于30個(gè)

7、血型系統(tǒng)，每種血型系統(tǒng)都會(huì)有很低的幾率不表達(dá)某種血型抗原。這類紅細(xì)胞便會(huì)呈現(xiàn)出稀有血型。使用常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)很難發(fā)現(xiàn)稀有血型的存在，在臨床上有可能會(huì)導(dǎo)致輸血反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)于很難用血清學(xué)方法檢測(cè)出的稀有血型個(gè)體，可以使用分子生物學(xué)方法，建立起穩(wěn)定的稀有血型檢測(cè)體系。對(duì)輸配血的個(gè)體進(jìn)行稀有血型檢測(cè)，最大可能降低由稀有血型引起的輸血反應(yīng)。
　　 根據(jù)CO、YT、LU、K、DI等血型基因的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出序列特異性引物，建立穩(wěn)定的擴(kuò)增

8、體系，并在一個(gè)體系中，進(jìn)行多種稀有血型抗原基因的篩查。經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化序列特異性引物與擴(kuò)增條件，建立了穩(wěn)定的稀有血型抗原基因擴(kuò)增體系。在研究中總共篩查了438例樣本（上海市隨機(jī)樣本321例，土族樣本61例，侗族28例，傈僳族28例）Coa、Kpb、yta、Lub、k、Dib、Jsbl910、Jsb2019等5個(gè)血型系統(tǒng)的8個(gè)抗原基因位點(diǎn)的篩查。經(jīng)多重PCR-SSP方法檢測(cè)，在所有樣本中，檢測(cè)出Coa陰性樣本o例，Kpb陰性樣本o例，yta陰

9、性樣本o例，Lub陰性樣本0例，k陰性樣本0例，Dib陰性樣本0例，Jsbl910陰性樣本0例，Jsb2019陰性樣本O例。
　　 本研究在常規(guī)對(duì)抗藥物抗體篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的對(duì)抗藥物抗體產(chǎn)生的機(jī)理也做出了初步的研究。并使用藥物代替常規(guī)標(biāo)記蛋白作為橋聯(lián)分子，采取Far-Western-Blotting的方法對(duì)RBC膜蛋白上的藥物靶位點(diǎn)進(jìn)行研究。通過(guò)建立藥物包被的RBC檢測(cè)抗藥物抗體并對(duì)其進(jìn)行機(jī)理性的研究，可以發(fā)現(xiàn)，在使用抗生素

10、的人群中，確實(shí)有一定的幾率出現(xiàn)抗藥物抗體。RBC在與頭孢菌素結(jié)合后，其表面某些蛋白含量會(huì)發(fā)生變化。另一方面，使用多重PCR-SSP對(duì)血型抗原基因進(jìn)行篩查，彌補(bǔ)了現(xiàn)有的血清學(xué)檢測(cè)方法僅能檢測(cè)少數(shù)稀有血型抗原，且應(yīng)用時(shí)往往受到抗體缺乏或效價(jià)低下的限制，擴(kuò)大稀有血型抗原檢測(cè)范圍，并應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。研究中雖然出現(xiàn)了假陽(yáng)性的結(jié)果，但只要配合血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其他進(jìn)一步的檢測(cè)，在輸血治療之前檢測(cè)稀有血型抗原表達(dá)情況，有助于針對(duì)性地篩選相配合的血