轉(zhuǎn)基因突變煙草雄性不育表型分析及分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、煙草是重要的生物學(xué)模式植物，又是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，因此煙草基因功能的研究對(duì)植物生物學(xué)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域都具有重要的意義。在模式植物擬南芥中，利用雄性不育突變體研究花粉發(fā)育相關(guān)基因功能是一種直接有效的策略。通過(guò)T-DNA插入的方法可以一次性獲得大量的突變體，用這種創(chuàng)造突變體庫(kù)的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草雄性育性相關(guān)基因功能的深入研究也是有可能的，因此對(duì)于已存在的煙草T-DNA插入雄性不育突變體的研究具有重要的意義。目前兩個(gè)煙草二倍體種全基因組測(cè)序的完

2、成，為煙草雄性育性相關(guān)基因功能的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)和研究平臺(tái)。本研究以一株轉(zhuǎn)基因T0代雄性不育煙草突變體為研究材料，利用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)等方法，對(duì)該突變體開(kāi)展組織形態(tài)、細(xì)胞學(xué)方面的研究。利用TAIL-PCR技術(shù)對(duì)T-DNA側(cè)翼序列進(jìn)行分離，根據(jù)側(cè)翼序列提供的基因信息，結(jié)合正向和反向遺傳學(xué)的方法，具體分析由T-DNA插入而產(chǎn)生雄性不育性狀的可能的基因。通過(guò)試驗(yàn)，得到如下結(jié)果:
　　(1)形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，突變

3、體與野生型植株在形態(tài)上無(wú)明顯差異。但生殖生長(zhǎng)階段，野生型成熟的花藥為綠色，大而飽滿，花粉粒多;而不育突變體成熟的花藥深褐色、瘦癟，花粉少而小，形態(tài)異常。野生型花器官比不育花大，且花絲不短于柱頭，但突變體的花絲大多短于柱頭。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示不育突變株每個(gè)花藥中的平均花粉數(shù)量少，多數(shù)花粉皺縮變小，花粉活力低，離體培養(yǎng)萌發(fā)率僅為10.6％。
　　(2)利用DAPI染色的方法判斷花粉發(fā)育時(shí)期，統(tǒng)計(jì)確定了野生型煙草和突變體煙草花粉發(fā)育各個(gè)時(shí)期所

4、對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度，對(duì)于以后的細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。并發(fā)現(xiàn)在花粉發(fā)育的各個(gè)階段，突變體的花蕾長(zhǎng)度均短于野生型。
　　(3)細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)合DAPI染色的結(jié)果說(shuō)明，雄性不育突變的體雄配子的發(fā)育異常出現(xiàn)在四分體釋放以后的單核小孢子期，其敗育特征為:四分體后小孢子形態(tài)異常，部分小孢子與降解不完全的胼胝質(zhì)發(fā)生粘連，最終這一部分小孢子無(wú)法繼續(xù)發(fā)育而降解;二核花粉粒時(shí)期，突變體花粉細(xì)胞內(nèi)明顯液泡化，多數(shù)小孢子無(wú)法正常進(jìn)行有絲分

5、裂形成雙核花粉粒，在以后的發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)不斷降解，最后內(nèi)容物極少或只剩下花粉壁空殼。
　　(4)掃描電鏡觀察花粉外壁形態(tài)，可見(jiàn)野生型花粉壁表面較平滑，不育花粉外壁表面有著豐富的紋飾，大多呈現(xiàn)條紋形，少數(shù)為點(diǎn)狀凹陷。進(jìn)一步對(duì)花粉壁構(gòu)造進(jìn)行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)突變體的柱狀體發(fā)育不良，造成后來(lái)頂蓋形成及孢粉素的沉積不均勻。
　　(5)將突變植株與野生型正反交得到代T1都為可育植株，說(shuō)明不是細(xì)胞質(zhì)遺傳類(lèi)型。T1種下后自交后對(duì)T2

6、代性狀分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)不育植株，推測(cè)種植的植株過(guò)少，目前已經(jīng)重新種下有待進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)。
　　(6)通過(guò)TAIL-PCR的方法獲得被插入的3段序列，通過(guò)生物信息學(xué)的方法，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Blast確定T-DNA在煙草基因組中的插入位點(diǎn)，確定了3個(gè)可能的候選基因:1個(gè)為煙草的X轉(zhuǎn)錄因子基因，T-DNA插入位點(diǎn)位于此基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)并且插入造成了該區(qū)域60bp堿基的缺失;另外2個(gè)是未定義蛋白基因，其中一個(gè)T-DNA可能插入到

7、它的3'UTR區(qū)域，另外一個(gè)基因只確定了部分轉(zhuǎn)錄序列，全長(zhǎng)序列尚有待RACE擴(kuò)增。
　　(7)利用qRT-PCR對(duì)野生型和不育突變體中三個(gè)基因不同部位表達(dá)量進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)X轉(zhuǎn)錄因子基因在兩個(gè)植株中表達(dá)差距明顯，又分別對(duì)花藥發(fā)育各個(gè)時(shí)期的三個(gè)候選基因的表達(dá)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)在花粉發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中X轉(zhuǎn)錄因子基因在突變體中的表達(dá)量均明顯低于野生型，另外未知蛋白基因在單核期的表達(dá)量遠(yuǎn)低于野生型。推測(cè)不育突變可能是X基因或者未知蛋白基