多殺菌素抗性西花薊馬轉(zhuǎn)錄組測序及nAChR α5和α7亞基的克隆分析.pdf

1、西花薊馬Frankliniella occidentalis(Pergande)是一種世界性的園藝作物上的主要害蟲，可為害蔬菜、花卉和果樹等多種作物。目前對于西花薊馬的防治包括生物防治、物理防治以及廣泛使用的農(nóng)藥防治等多種方法，其中藥劑防治最為普遍。但由于西花薊馬發(fā)育周期短、繁殖力強、具有單雙倍體繁殖系統(tǒng)，以及雜食性的特點，西花薊馬可通過多種途徑對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，成為抗藥性最為嚴重的害蟲之一。國外已有西花薊馬對防治其最有效的藥劑——多

2、殺菌素產(chǎn)生了極高水平抗性的報道，國內(nèi)西花薊馬對多殺菌素的敏感性也呈下降趨勢。根據(jù)已有文獻，不同多殺菌素抗性西花薊馬種群的抗性機理存在明顯差異，研究本地區(qū)西花薊馬對多殺菌素的抗性機制對西花薊馬的抗性治理具有十分重要的意義。本文研究了西花薊馬在低溫下的生長發(fā)育及繁殖狀況，對多殺菌素敏感和抗性西花薊馬的轉(zhuǎn)錄組進行了測序，并根據(jù)RNA-seq結(jié)果對西花薊馬煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)α5和α7亞基進行了克隆和分析。上述研究可進一步了解西花薊

3、馬的生物學(xué)特性、闡明西花薊馬對多殺菌素的抗性機制，為西花薊馬的有效防治提供理論依據(jù)。
　　常年用多殺菌素處理的豆角飼喂該殺蟲劑的抗性種群，通過不斷的汰選，抗性種群對多殺菌素的LC50＞3，000mg/L，抗性倍數(shù)穩(wěn)定在10，000倍以上，達到了極高抗性水平。敏感種群不接觸任何藥劑，兩種群隔離飼養(yǎng)，為后續(xù)研究奠定了試蟲基礎(chǔ)。
　　通過對5℃和10℃環(huán)境下西花薊馬生長發(fā)育和繁殖等狀況的觀察研究，發(fā)現(xiàn)西花薊馬具有較高的低溫耐受性，

4、在5℃下西花薊馬無法完成生命周期，卵無法正常孵化，1齡若蟲可以發(fā)育到2齡，但2齡若蟲不能繼續(xù)發(fā)育至蛹;蛹能夠發(fā)育至成蟲但成蟲不能產(chǎn)卵;10℃下西花薊馬能夠完成生活史，但是發(fā)育歷期顯著延長。結(jié)果表明，低溫導(dǎo)致西花薊馬的發(fā)育速度減慢，后代數(shù)量驟減，但西花薊馬轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境后，能夠恢復(fù)正常生長，說明其具有很強的低溫耐受性。
　　對多殺菌素敏感和抗性種群進行RNA-seq，得到了西花薊馬的68，358個unigenes基因，其中與殺蟲劑抗

5、性相關(guān)的20類基因共1655個unigenes，能夠與NCBI-NR庫中已公布基因比對上的基因565個，在目前尚無西花薊馬基因組數(shù)據(jù)的情況下，這無疑很大程度地豐富了西花薊馬的基因數(shù)據(jù)信息;經(jīng)差異基因分析，發(fā)現(xiàn)兩種群間差異表達基因2，618個，其中抗性種群內(nèi)表達上調(diào)的基因1，231個，表達下降的基因1，387個;發(fā)現(xiàn)抗性種群中與SOD相關(guān)的基因過表達，上調(diào)倍數(shù)247倍;抗性種群的細胞色素P450s的上調(diào)倍數(shù)也高于本家族其他基因的下調(diào)倍數(shù)。

6、經(jīng)過對RNA-seq數(shù)據(jù)的qPCR驗證，證明RNA-seq得到的差異表達基因是可靠的，可用于指導(dǎo)對西花薊馬多殺菌素抗性的產(chǎn)生機制進行研究。
　　在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，克隆獲得了西花薊馬nAChRα5亞基和nAChRα7亞基基因CDS全長，經(jīng)同源比對確定這兩個基因為西花薊馬該受體的α5和α7基因;它們的表達量在兩種群間均無顯著差異。nAChRα7在兩種群間無序列差異，而nAChRα5在抗性種群中存在A-E五種轉(zhuǎn)錄本，在敏感種群中只有