芍藥灰霉病抗性差異的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析研究.pdf

1、芍藥是中國(guó)的傳統(tǒng)名花，因其極高的觀賞價(jià)值而被廣泛應(yīng)用于植物造景和庭院綠化中，目前在世界50多個(gè)國(guó)家廣為栽培。然而在生產(chǎn)實(shí)踐中，芍藥容易感染灰霉病，導(dǎo)致其葉片干枯壞死，莖部凹陷折倒，花瓣褐色腐爛，甚至整個(gè)植株死亡，嚴(yán)重影響植株的觀賞效果和商業(yè)價(jià)值。因此，明晰芍藥抗灰霉病的關(guān)鍵基因和miRNA及其分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)芍藥抗灰霉病品種的選育工作具有重要的理論價(jià)值。為此，本研究對(duì)揚(yáng)州地區(qū)芍藥灰霉病的病原進(jìn)行了形態(tài)和分子鑒定，并對(duì)抗病品種‘紫鳳羽’和

2、感病品種‘大富貴’進(jìn)行了數(shù)字基因表達(dá)譜和小RNA測(cè)序分析，鑒定了與抗病相關(guān)的代謝途徑，挖掘了與抗病相關(guān)的差異表達(dá)基因和miRNA，主要結(jié)果如下:
　　(1)采集芍藥灰霉病病葉進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，待其產(chǎn)孢后鏡檢，初步鑒定為葡萄孢屬（Botrytis）;致病性及寄主范圍的測(cè)定顯示病原菌不僅侵染芍藥，也能導(dǎo)致梔子、番茄、月季、山茶、青椒、黃瓜、白菜這7種寄主植物發(fā)病;rDNA-ITS序列分析表明其與Genbank中的灰葡萄孢同源性達(dá)到9

3、9％;以上結(jié)果鑒定揚(yáng)州地區(qū)芍藥灰霉病病原是灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）。
　　(2)采集抗病品種‘紫鳳羽’和感病品種‘大富貴’四個(gè)時(shí)期的葉片，構(gòu)建8個(gè)cDNA文庫(kù)（‘Zifengyu’-S1-‘Zifengyu’-S4，‘Dafugui’-S1-‘Dafugui’-S4）進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序，去除低質(zhì)量reads后每個(gè)文庫(kù)的cleans reads均超過(guò)11，680，333。將不同文庫(kù)間進(jìn)行基因表達(dá)量

4、的比較，篩選到差異表達(dá)基因(DE Gs)最多的是‘Zifengyu’-S1 vs.‘Zifengyu’-S4(6843個(gè)，其中4916個(gè)上調(diào)，1927個(gè)下調(diào))和‘Dafugui’-S1 vs.‘Dafugui’-S4（10355個(gè)，其中5737個(gè)上調(diào)，4618個(gè)下調(diào)）。將DEGs比對(duì)上GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，篩選到植物與病原菌互作、次生代謝合成以及抗氧化系統(tǒng)等與抗病密切相關(guān)的途徑，并分別從中鑒定了51、76和13個(gè)抗病相關(guān)候選

5、基因。這些候選基因在受到灰霉病侵染后幾乎都上調(diào)，并且在兩品種中有著不同的表達(dá)模式:在‘紫鳳羽’的感病早期就大幅上調(diào)表達(dá)，而在‘大富貴’中則是逐漸上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明芍藥在受到灰葡萄孢脅迫誘導(dǎo)多重抗病反應(yīng)，包括激活PTI和ETI免疫反應(yīng)，合成木質(zhì)素、植保素、苯并噁嗪類物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)抗氧化酶表達(dá)水平以清除活性氧;‘紫鳳羽’因?yàn)樽R(shí)別病原、激發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)速度快并且抗病基因表達(dá)強(qiáng)烈，所以比‘大富貴’更能有效抵御病原菌的侵害。
　　

6、(3)將‘紫鳳羽’和‘大富貴’四個(gè)時(shí)期的葉片分別均勻混合，構(gòu)建2個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行小RNA測(cè)序。去除低質(zhì)量的reads后，分別從‘Zifengyu’和‘Dafugui’中得到23，520，582和21，452，306條clean reads，拼接后獲得4，592，881和5，809，796個(gè)小RNA。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和軟件預(yù)測(cè)，分別從‘Zifengyu’和‘Dafugui’中鑒定271和298個(gè)保守miRNAs，9和8個(gè)新miRNAs。在兩

7、個(gè)品種的差異表達(dá)分析中獲得237個(gè)保守miRNAs（136個(gè)上調(diào)，101個(gè)下調(diào)）和7個(gè)新miRNAs（2個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)），并對(duì)其靶基因進(jìn)行了功能注釋。在KEGG注釋中篩選到與7個(gè)候選miRNAs相對(duì)應(yīng)的9個(gè)抗病相關(guān)靶基因，分別包含于苯丙烷生物合成、二萜生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物與病原菌互作等抗病相關(guān)途徑中。將候選miRNA與其相應(yīng)靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)miR5254、miR165a-3p、miR3897-3p和miR