天山根瘤菌MsiR蛋白調(diào)控機理的研究.pdf

1、中慢生型天山根瘤菌能夠在甘草的根部共生結(jié)瘤固氮，提供植物生長所需的氮源。這種共生關(guān)系的建立依賴于根瘤菌與宿主植物之間復(fù)雜的信息交流。在甘草萌發(fā)初期，其分泌的抗菌物質(zhì)刀豆氨酸能夠殺死植株周圍可能的有害細菌，而在天山根瘤菌中存在著刀豆氨酸的外運系統(tǒng)MsiAR系統(tǒng)，使其在甘草根際選擇性的環(huán)境下繼續(xù)繁殖，成為優(yōu)勢菌群，為后來的結(jié)瘤共生提供有力條件。
　　MsiR蛋白，屬于LysR轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族成員，能夠啟動msiA基因的表達，刀豆氨酸作為輔

2、助誘導(dǎo)物。LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白是原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白中最大的一類家族蛋白，參與調(diào)控的基因類型多種多樣，包括毒力、代謝、群體感應(yīng)和游動性等多種功能基因。本文以MsiR為主要研究對象，探究MsiR對msiA基因表達的調(diào)控機制，豐富對LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的認(rèn)識，實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的價值。
　　為研究MsiR對msiA的調(diào)控機制，將MsiR在大腸桿菌中進行重組表達及純化。通過EMSA實驗證實MsiR蛋白與啟動子DNA的結(jié)合，加入刀豆氨酸

3、能增強這種結(jié)合。與此同時，通過等溫量熱滴定確定了刀豆氨酸與MsiR之間存在相互作用，刀豆氨酸與MsiR結(jié)合的化學(xué)計量數(shù)為1，Kd值為1.86μM。
　　通過5'race實驗確定了msiA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，并由此推測了-10區(qū)和-35區(qū)。采用啟動子長度步移及定點突變確定了影響MsiR轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的5個重要位點:RBS-1(-70,-67)、RBS-2(-59,-56)、 ABS-1(-50,-47)、 ABS-2(-41,-37)

4、、ABS-3(-30，-27)，并由此預(yù)測了MsiR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型:
　　無刀豆氨酸存在的情況下，MsiR以四聚體形式存在，并呈現(xiàn)出開放型的構(gòu)象，其結(jié)合到msiA調(diào)控區(qū)的RBS-1、RBS-2、ABS-2、ABS-3位點。此時，DNA的彎曲角度較緩，MsiR遮住了msiA啟動子的-35區(qū)，使RNA聚合酶與啟動子DNA結(jié)合效率大大降低，基因的表達水平處于極低的狀態(tài)。
　　在加入了刀豆氨酸以后MsiR仍以四聚體形式存在，但轉(zhuǎn)