冠心病新危險標志物ADMA與促炎因子MIF和AGEs的相關性研究.pdf

1、研究背景:
　　 心血管疾病在發(fā)達國家已成為致死率最高的疾病，在發(fā)展中國家也日趨嚴重，每年導致約1670萬人死亡。這其中，尤其是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（又稱冠心病，coronary heart disease，CHD）嚴重威脅現(xiàn)代人類生命健康。CHD根本的病理學特征就是冠狀動脈粥樣硬化(AS)。近年來隨著對疾病的研究深入，證明炎癥反應在AS的發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用。
　　 目前臨床實踐中，血清C反應蛋白(CRP)

2、的檢測可作為反映機體動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程的一項最敏感的炎性指標。但研究發(fā)現(xiàn)，CRP在所有的炎性癥狀下都會升高，因而對于CHD的診斷缺乏特異性。流行病學研究證明高血脂、高血壓、糖尿病以及吸煙等危險因素與冠心病的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。但是大約50％的心血管疾病患者并不能用傳統(tǒng)意義上的危險因素來解釋。提前診斷對于心血管疾病這類慢性、長期而嚴重的疾病來說是重要的，因此迫切需要更好的生物標志物來預測未來發(fā)生冠心病的風險，這樣將在疾病早期就可以

3、進行干預，改善甚至逆轉疾病進程。
　　 非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是蛋白質上的精氨酸殘基在蛋白精氨酸甲基轉移酶(protein argininemethyltransferase，PRMT-1)的催化作用下產生;大部分ADMA由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethyl arginine dimethylaminohydrolase-2，DDAH-2)水解代謝。 A

4、DMA的升高與PRMT-1與DDAH-2這兩個酶的活性或含量改變有關。ADMA能與L-精氨酸競爭，是一種內源性的一氧化氮合酶(NOS)競爭性抑制劑，能使具血管保護作用性物質一氧化氮(NO)的生成減少，而導致內皮功能的紊亂。研究表明，高ADMA血癥與心腦血管疾病密切相關，ADMA可能是動脈粥樣硬化一個新的危險因素。
　　 巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是

5、在結構上高度保守的、獨特的免疫調節(jié)因子;也是一種強有力的炎癥前細胞因子，主要來源于T細胞和單核巨噬細胞。近十年來我們課題組對其做了大量研究， MIF與心血管疾病相關如動脈硬化、心衰等疾病呈正相關性。
　　 晚期糖基化終末產物(advanced glycated end-products，AGEs)是蛋白被糖化修飾后的產物，在正常老化過程中，AGEs逐步形成和積累，但在高血糖或氧化應激條件下AGEs則會加速積累。臨床研究證明，AG

6、Es能促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。
　　 為探尋冠心病新的生物標志物，本課題將圍繞ADMA與促炎因子MIF、AGEs的關系展開研究。
　　 第一章冠心病患者外周血漿中ADMA、MIF的含量測定
　　 1.1研究目的:
　　 檢測冠心病患者血漿中ADMA、MIF的含量，并與健康人比較，分析ADMA、MIF與疾病的關系，并進一步分析ADMA與MIF的關系。探討ADMA是否可作為冠心病潛在的預測、預后指標乃至

7、潛在的治療耙點。
　　 1.2研究方法:
　　 1.2.1標本的采集與處理
　　 1.于2011年7月至2011年12在廣東省人民醫(yī)院心血管病研究所收集經冠狀動脈造影確診為冠心病患者肘靜脈血2ml于EDTA抗凝管中（早晨，在患者空腹時），(4℃，1500rpm/min)離心20分鐘，收集上層血漿于無菌1.5ml EP管中，-70℃保存，待用;在體檢中心收集健康對照人群樣本，血液處理方法同上。
　　 2.查

8、詢所患者病歷，排除標準為長期服用免疫抑制劑史;再發(fā)性心肌梗死;惡性腫瘤;腎功能不全;近半年內接受過重大手術;有急性或慢性感染性疾病;嚴重電解質紊亂的患者。
　　 3.病例組根據有沒有接受PCI以及PCI術后的時間長短分為三個亞組:分別指確診為冠心病但沒有接受PCI的病例、剛接受PCI術的病例（七天內）、及人大于6個月的病例。
　　 1.2.2人血漿中MIF及AD姒含量的檢測
　　 (1) Elisa檢測人血漿中M

9、IF的含量
　　 MIF的測定采用定量的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)。
　　 (2) Elisa檢測人血漿中ADMA的含量
　　 ADMA的測定采用定量的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)。
　　 1.2.3實時熒光定量PCR檢測MIF、CD74mRNA表達水平
　　 提取全血中白細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后，分別使用MIF、CD74的特異引物，內參為β-actin，從基因水平檢測mRNA的相對

10、表達。
　　 1.2.4 AD姒與MIF的相關性研究
　　 采用Pearson相關分析，分析ADMA與MIF的相關性。
　　 1.3研究結果:
　　 1.3.1人血漿中ADMA、MIF及含量的檢測
　　 (1)對照組與冠心病組外周血漿中MIF的含量分別為:1103±508.0pg/ml(對照組，n=62);1422±697.2pg/ml(冠心病組，n=173)(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。接

11、受PCI術后的時間長短與MIF含量無顯著關系(p＞0.05)，但可以看到在接受PCI后，隨著時間的延長其MIF的含量有降低趨勢。
　　 (2)檢測ADMA結果為:對照組，170.7±19.93 ng/ml，n=24;冠心病組，253.8±12.88 ng/ml，n=80(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 1.3.2MIF mRNA與CD74mRNA相對表達水平
　　 冠心病人群中MIF與CD74 mRNA

12、的相對表達水平與健康組相比有上升的趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異(見圖1-4C)。
　　 1.3.3 ADMA與MIF的相關性研究
　　 Pearson分析結果為，r=0.238，p=0.035，ADMA與MIF顯示出相關性。
　　 1.4結論:
　　 本研究結果顯示，冠心病患者血漿ADMA與對照組相比明顯增高，并伴隨著促炎因子MIF的增高，ADMA與MIF顯示出相關性。提示ADMA可能參與了慢性炎癥過程，并可作

13、為判斷冠心病病情活動的有效指標。
　　 第二章ADMA與MIF相互作用的研究
　　 2.1研究目的:
　　 以人內皮細胞為研究對象，通過探討ADMA與MIF相互作用，研究ADMA是否參與了炎癥所致的內皮損傷過程及其在動脈粥樣硬化中的可能病理生理機制。
　　 2.2實驗方法:
　　 2.2.1 Eahy926細胞的培養(yǎng)
　　 于6孔板中培養(yǎng)，使用DMEM F12培養(yǎng)基，10％ FBS，當細胞

14、融合70％時，先用PBS洗兩遍，然后加入含1％FBS的培養(yǎng)基過夜后，加入含不同濃度MIF(0，2，5，20ng/ml)，共培養(yǎng)24小時。
　　 2.2.2細胞總RNA的提取
　　 按2.2.1方法處理細胞結束后，采用Trizol法提取細胞中的RNA。
　　 2.2.3RT-qPCR檢測細胞總RNA中相關蛋白mRNA相對表達水平
　　 首先逆轉錄為cDNA，然后Q-RCR檢測測組織因子(TF)、基質蛋白酶(

15、MMP-1)、內皮素(ET-1)、PRMT-1、DDAH-2、內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA相對表達水平。
　　 2.2.4硝酸根亞硝酸酶法檢測細胞上清中NO水平
　　 按2.2.1方法細胞處理結束后，收集細胞培養(yǎng)基上清液測NO。
　　 2.2.5熒光顯微鏡檢測Eahy926中ROS水平
　　 按2.2.1方法處理細胞結束后，加入適量DCFH-DA溶液，使培養(yǎng)液中DCFH-DA終濃度為10μM，

16、將培養(yǎng)板放進37℃培養(yǎng)箱孵育15min。15min后按比例(1∶1000)再加入Hoechst33342，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育15min。去除細胞上清，用PBS輕輕洗2-3次后，每孔加入1mL培養(yǎng)基，熒光顯微鏡觀察各組細胞熒光信號的變化并拍攝熒光照片。
　　 2.2.6 AD姒處理內皮細胞后檢測MIF的表達
　　 按2.2.1方法處理細胞，采用ADMA處理，分別為0、5、20、50μM ADMA。分別采用免疫熒光與Wes

17、tern blot檢測MIF的表達水平。
　　 2.3結果:
　　 2.3.1細胞總RNA中相關蛋白mRNA相對表達情況
　　 在使用20ng/ml MIF刺激時，ET-1、TF及MMP-1的mRNA的相對表達水平都明顯升高(p＜0.05);與此同時，與NO生成相關的eNOS、DDAH-2mRNA水平則降低(p＜0.05)，RPMT-1的變化不顯著（詳細結果見圖2-1）。
　　 2.3.2細胞上清中NO水

18、平
　　 加入20ng/ml組NO均值為14.4μM，Control組均值為27.5μM(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，其他組變化不顯著。
　　 2.3.3內皮細胞中ROS水平
　　 熒光顯微鏡下，20ng/ml MIF組中，代表ROS水平的綠色熒光比Control增加明顯，其他濃度組則增多不明顯(詳細結果見圖2-2)。
　　 2.3.4 AD姒處理內皮細胞檢測MIF的表達情況
　　 在20、

19、50μMADMA組，MIF的表達明顯增多（詳細結果見圖2-3與2-4）。
　　 2.4結論:
　　 MIF能通過影響炎性因子的表達以及ROS的生成，從而影響ADMA相關代謝酶的變化。同時，ADMA亦能上調MIF在內皮細胞中的表達，驗證了ADMA的促炎作用。
　　 第三章 ADMA與AGEs相互作用的研究
　　 3.1研究目的:
　　 探討AGEs是否影響PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路而影

20、響NO的生成，而導致內皮功能紊亂，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，從而進一步驗證ADMA的促炎作用。
　　 3.2研究方法:
　　 3.2.1 AGEs對AD姒相關代謝酶PRMT-1與DDAH-2的基因表達水平的影響
　　 使用不同濃度的AGEs(0，20，50，100μg/ml)處理Eahy926細胞，并加入沒有糖基化的球蛋白做陰性對照，共培養(yǎng)24、48小時。細胞處理結束后，采用Trizol法提取總RNA，實時熒

21、光定量PCR檢測PRMT-1與DDAH-2 mRNA的相對表達水平。
　　 3.2.2 AGEs對ADMA相關代謝酶PR MT-1與DDAH-2的蛋白表達水平的影響
　　 按3.2.1方法細胞處理結束后，提取總蛋白，采用western blot檢測PRMT-1與DDAH-2的蛋白表達水平。
　　 3.2.3熒光顯微鏡檢測AGEs處理內皮細胞后ROS的變化
　　 按3.2.1方法細胞處理結束后，按2.2.5

22、法檢測ROS。
　　 3.3結果:
　　 1.AGEs對ADMA相關代謝酶PRNT-1與DDAH-2的基因表達水平的影響
　　 50μg/ml和100μg/ml AGEs組中，PRMT-1 mRNA相對表達水平(folds)與Control組和陰性對照組相比上升明顯;而DDAH-2 mRNA(folds)與Control組和陰性對照組相比顯著下降(p＜0.01)，同時Control組和陰性對照組之間無統(tǒng)計學意義，

23、而25μg/ml組(folds)則與對照組和陰性對照組相比差異不明顯。(詳細結果見圖3-1)
　　 2.AGEs對ADMA相關代謝酶PRMT-1、DDAH-2表達水平的影響
　　 當使用20μg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs刺激24h時，與Control組相比，PRMT-1蛋白表達上升明顯;DDAH-2則在50μg/ml、100μg/ml AGEs刺激24h時下降;同時在培養(yǎng)48小時時，看到了相同的趨勢

24、。（詳細結果見圖3-2與3-3）
　　 3.熒光顯微鏡檢測AGEs處理內皮細胞后ROS的變化
　　 熒光顯微鏡下觀察，與對照組和陰性對照組相比，加入20μg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs各組中，代表ROS綠色熒光相對生成較多，其中100μg/mlAGEs組ROS含量最多。（詳細結果見圖3-4）
　　 3.4結論:
　　 AGEs可以通過誘導ROS的生成，影響PRMT-1/ADMA/DDA

25、H-2通路。
　　 全文小結:
　　 1.本研究結果顯示，冠心病患者血漿ADMA與對照組相比明顯增高，并伴隨促炎因子MIF的增高，ADMA與MIF顯示出相關性。揭示了炎性反應、內皮功能與心血管疾病之間的關系，提示ADMA可能參與了慢性炎癥過程，并可作為判斷冠心病病情活動的有效指標。
　　 2.發(fā)現(xiàn)了MIF能夠影響ADMA-NO通路，而ADMA也能增加MIF的表達，驗證了ADMA的促炎作用。
　　 3.AG