微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型建立與染色方法的比較.pdf

1、研究背景：
　　盡管目前冠心病的診療措施取得較大的進(jìn)展，冠心病仍然是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡的主要原因之一。2010年我國有近360萬人死于心血管疾病，平均每天逾9，800人死于心血管病。急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)為冠心病急癥，其包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、心性猝死等一系列臨床病理生理狀態(tài)。易損斑塊破裂、繼發(fā)血栓形成，使血流急劇減少或者完全阻斷，是ACS的主要病理生理基礎(chǔ)。一般認(rèn)為易

2、損斑塊的形態(tài)學(xué)特征包括:薄纖維帽(＜65μm)、大脂質(zhì)核心、大量激活巨噬細(xì)胞及炎癥浸潤。目前認(rèn)為導(dǎo)致易損斑塊破裂的原因有脂質(zhì)核心的擴(kuò)大、斑塊內(nèi)炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)合成減少及降解增加，局部應(yīng)力增加等。雖然關(guān)于易損斑塊破裂的機(jī)制研究取得重大進(jìn)展，但易損斑塊破裂的機(jī)制尚不完全清楚，仍存在一些矛盾的地方，需進(jìn)一步識別影響斑塊穩(wěn)定性的其他因素，促使其向穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)化，對于預(yù)防急性心血管事件的發(fā)生具有重要意義，也是臨床上目前需要急待解決的關(guān)鍵問題。

3、>　　鈣化是動脈粥樣硬化的一個(gè)顯著特征。與之前的體積較大的鈣化不同，近期利用高分辨率的激光共聚焦顯微鏡和micro-ct發(fā)現(xiàn)一種直徑在微米水平的點(diǎn)狀鈣化，稱為微鈣化。微鈣化在斑塊內(nèi)分布廣泛，纖維帽、脂質(zhì)核心中均可發(fā)現(xiàn)微鈣化。微鈣化對斑塊穩(wěn)定性的影響愈發(fā)受到關(guān)注。Vengrenyuk等首次利用Goodier數(shù)學(xué)模型證實(shí)薄纖維帽處(＜65μm)的微鈣化可使其周圍的應(yīng)力加倍，引起界面分離，導(dǎo)致斑塊破裂。隨后學(xué)者又利用數(shù)學(xué)模型證實(shí)微鈣化的空間位

4、置及形態(tài)影響其對斑塊穩(wěn)定性的作用。狹長形微鈣化比球形微鈣化增加的應(yīng)力更多。微鈣化能解釋某些目前解釋不清的斑塊破裂，成為新的重要的影響斑塊穩(wěn)定性的因素。但目前仍存在一些問題，對微鈣化的研究都是基于三維模擬及數(shù)學(xué)模型分析，它的準(zhǔn)確性尚需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。相關(guān)的微鈣化動物模型缺乏，限制微鈣化的體內(nèi)研究。因此建立微鈣化動脈粥樣硬化斑塊動物模型及可識別微鈣化的病理學(xué)染色方法成為體內(nèi)驗(yàn)證、進(jìn)一步研究微鈣化的關(guān)鍵。
　　動脈粥樣硬化的發(fā)生與局部

5、的血流動力學(xué)因素密切相關(guān)。血流與內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦產(chǎn)生的剪切力在內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及動脈粥樣硬化進(jìn)程中作用重大。低剪切力和振蕩剪切力是造成動脈粥樣硬化病變非隨機(jī)灶性分布的主要因素。內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的力學(xué)敏感受體識別剪切力信號并將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生化信號，引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。低剪切力、振蕩剪切力作用下，內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞粘附分子、活性氧產(chǎn)生增多，促進(jìn)單核細(xì)胞粘附、低密度脂蛋白氧化修飾，加速動脈粥樣硬化發(fā)生。血流剪切力的變化不僅參與動脈

6、粥樣硬化的發(fā)生，且與斑塊內(nèi)鈣化密切相關(guān)。Stefan等通過血管內(nèi)超聲及虛擬組織顯像技術(shù)分析冠狀動脈分支處斑塊負(fù)荷及組織成份，發(fā)現(xiàn)在分支的對側(cè)壁，即一般認(rèn)為的低剪切力區(qū)，斑塊負(fù)荷大且鈣化嚴(yán)重。利用符合流體力學(xué)原理的套管可實(shí)現(xiàn)同時(shí)模擬不同形式的剪切力。
　　目前兔腹主動脈內(nèi)皮球囊機(jī)械性損傷加高脂飼料喂養(yǎng)是復(fù)制動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)模型。在該模型中，可見斑塊內(nèi)富含脂質(zhì)、膠原，炎性細(xì)胞浸潤亦可在該類動物模型中得以復(fù)制，但鈣化發(fā)生較少。為建立合

7、適的微鈣化動脈粥樣硬化兔模型，需對傳統(tǒng)模型加以改進(jìn)。鑒于血流剪切力對動脈粥樣硬化及鈣化的影響，本實(shí)驗(yàn)意在傳統(tǒng)模型的基礎(chǔ)上引入腹主動脈套管縮窄術(shù)，模擬不同形式的剪切力，在內(nèi)皮損傷炎癥、高脂環(huán)境、血流剪切力三重因素作用下，以期建立微鈣化動脈粥樣硬化斑塊模型，使微鈣化的體內(nèi)驗(yàn)證成為可能。
　　茜素紅S(Alizarinreds)和馮·科薩(Vonkossa)染色是組織學(xué)上常用的鈣質(zhì)染色技術(shù)。二者的原理不同，馮·科薩染色利用硝酸銀溶液與鈣

8、鹽的磷酸根或碳酸根反應(yīng)生成相應(yīng)的磷酸銀或碳酸銀，后者可被日光或者紫外線還原為黑灰或黑色的金屬銀;茜素紅S通過結(jié)構(gòu)中的硫酸基團(tuán)及羥基基團(tuán)與鈣離子反應(yīng)形成粉紅色或紅色鈣鹽。茜素紅S染料具有熒光活性，染色結(jié)果可利用分辨率高的激光共聚焦顯微鏡觀察。利用本實(shí)驗(yàn)建立的微鈣化動脈粥樣硬化斑塊模型對比茜素紅S和馮·科薩這兩種常用的鈣質(zhì)染色技術(shù)用于微鈣化染色的可行性和異同點(diǎn)，為日后進(jìn)一步研究微鈣化提供技術(shù)支持。
　　研究內(nèi)容：
　　(1)建立

9、微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型
　　(2)比較茜素紅S和馮·科薩染色用于微鈣化染色的可行性和異同點(diǎn)
　　研究方法：
　　30只雄性新西蘭兔，在高脂飼料喂養(yǎng)和腹主動脈內(nèi)皮球囊損傷基礎(chǔ)上，隨機(jī)分為套管組（給予腹主動脈雙楔形套管縮窄）和非套管組，每組各15只，喂養(yǎng)12周。應(yīng)用體表超聲檢查兩組術(shù)前及術(shù)后12周腹主動脈的平均血流速度、舒張末期內(nèi)徑，同時(shí)檢測血液粘滯度，計(jì)算術(shù)前及術(shù)后12周的血流剪切力。安樂死動物后，取兩組相對應(yīng)的腹

10、主動脈為組織標(biāo)本，制成石蠟、冰凍切片。通過常規(guī)的病理學(xué)染色及免疫組織化學(xué)測定斑塊內(nèi)脂質(zhì)、膠原、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的含量。對連續(xù)的石蠟切片分別進(jìn)行茜素紅S和馮·科薩染色，染色結(jié)果在普通光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　研究結(jié)果：
　　(1)套管組和非套管組均形成動脈粥樣硬化斑塊。
　　(2)套管組微鈣化發(fā)生率和鈣化面積高于非套管組(P＜0.05)。
　　(3)茜素紅S和馮·科薩染色識別微鈣化的敏感性相同，