篩選一種橘皮化合物5-ATAN對(duì)MCF-7的凋亡作用及其機(jī)制研究.pdf

1、在人們的日常飲食中,平均每天黃酮的攝入量大約在150毫克到300毫克之間,這其中大約有10％來(lái)自一種最常見(jiàn)的水果,柑橘。柑橘的主要成分是酚類(lèi)化合物,氨基酸、揮發(fā)油、果膠、胡蘿卜素、類(lèi)黃酮和維生素C。橘子中的多種化合物和我們健康有著密切的聯(lián)系,尤其是橘皮黃酮展示出的增加血清中抗氧化能力,防止脂質(zhì)過(guò)氧化、減少老年人的氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥狀硬化、作為化療的輔助藥物、作為糖尿病患者的保健食品以及神經(jīng)保護(hù)作用等一系列廣泛的生物學(xué)功能,

2、越來(lái)越引起人們的注意。
　　本課題首先通過(guò) MTT法探究六種不同橘皮化合物5- Acetyloxy-6,7,8,4'-tetramethoxyflavone(5-ATAN), Hesperidin(HPD), Nobiletin(NOB),Sinesetin(SIN), E為 Tangeretin(TAN),5,6,7,4'– Tetramethoxyflavone(TMF)對(duì)人源乳腺導(dǎo)管腺癌MCF-7細(xì)胞作用24后的細(xì)胞存活率。

3、篩選到一種在很低濃度便可以抑制 MCF-7細(xì)胞活性的化合物5-Acetyloxy-6,7,8,4'-tetramethoxyflavone(5-ATAN)。5-ATAN的IC50最小為5.51μM,即表示在5.51μM濃度的情況下,5-ATAN作用MCF-7細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞抑制率為50%。相比TAN,5-ATAN只是在TAN的第5位碳原子上修飾了一個(gè)乙酰基團(tuán),其抑制率便大大增加。反復(fù)加熱和干燥生產(chǎn)的陳皮能轉(zhuǎn)換 TAN成為一種與其相似的

4、化合物即在 Tangeretin的主環(huán)的 C5位上的甲基被乙?；鶊F(tuán)所替代,便是5-ATAN,而5-ATAN又是陳皮中大量含有的化合物之一。
　　本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究5-ATAN對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的影響,包括促進(jìn)凋亡的作用和抑制增殖的作用兩方面。結(jié)果表明,在5-ATAN作用 MCF-7細(xì)胞不同時(shí)間后,既出現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞核增殖抗原PCNA的抑制現(xiàn)象又出現(xiàn)了誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的DNA斷裂及細(xì)胞核皺縮等一系列的凋亡現(xiàn)象。在隨后的研究中,本課題

5、著重于凋亡作用的研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在5-ATAN介導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的凋亡中,Caspase依賴的信號(hào)通路和Caspase非依賴的信號(hào)通路都有所涉及,在Caspase非依賴的信號(hào)中,本課題采用免疫熒光的方法觀察到AIF的核轉(zhuǎn)位,并用WesternBlot的方法檢測(cè)到H2AX的磷酸化;在Caspase依賴的信號(hào)通路中,本實(shí)驗(yàn)首先采用WesternBlot觀察到Caspase依賴的信號(hào)通路的中Caspase家族重要的執(zhí)行者Caspase-

6、3的活化和Caspase–3的下游靶蛋白PARP的活化,隨后在5-ATAN作用MCF-7細(xì)胞較短的時(shí)間內(nèi),檢測(cè)Caspase依賴的兩條凋亡信號(hào)通路的上游限號(hào),本課題通過(guò) WesternBlot法觀察到,死亡受體的相關(guān)的外源性凋亡通路并不發(fā)生明顯的活化;而線粒體相關(guān)的內(nèi)源性凋亡通路活化明顯,包括促凋亡蛋白Bax的增加,抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白的減少,進(jìn)而使得線粒體膜電位下降,細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中,激活Caspase-9最后激

7、活Caspase-3,使得活化PARP活化產(chǎn)生大量的DNA片段。
　　為了更加充分地證明5-ATAN介導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡途徑中,Caspase依賴的線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑參與到其中,本課題通過(guò)5-ATAN與Caspase特異性的聯(lián)合抑制劑。結(jié)果表明Caspase廣泛抑制劑Z-VAD-FMK并不能完全逆轉(zhuǎn)5-ATAN對(duì)MCF-7的抑制其存活的作用,暗示著除了Caspase依賴的信號(hào)通路參與到其中來(lái),如Caspase非依賴的細(xì)胞凋