家蠶Bac-to-Bac表達系統(tǒng)供體質(zhì)粒的構(gòu)建及表達抗腫瘤T2融合蛋白的研究.pdf

1、家蠶桿狀病毒基因表達系統(tǒng)是高效的真核表達系統(tǒng)之一。借鑒國外AcMNPV Bac-to-Bac快速基因表達系統(tǒng)工作原理,我們曾構(gòu)建了可利用我國特色經(jīng)濟資源昆蟲一家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達系統(tǒng)。利用細菌轉(zhuǎn)座子的基因定位轉(zhuǎn)移作用,在大腸桿菌內(nèi)實現(xiàn)基因的重組,快速獲得重組病毒。利用該系統(tǒng),僅需要5-7天就能得到重組病毒。該系統(tǒng)由供體質(zhì)粒、DH10BmBac細菌感受態(tài)細胞和家蠶培養(yǎng)細胞、家蠶幼蟲組成,利用該系統(tǒng)能夠在家蠶體內(nèi)表達重組外

2、源蛋白。
　　 在家蠶Bac-to-Bac快速表達系統(tǒng)中,供體質(zhì)粒為重組病毒的構(gòu)建提供含有目的基因表達框(啟動子+多克隆位點)的轉(zhuǎn)座元件,因此其中的表達框決定了所攜外源蛋白的表達方式以及下游蛋白質(zhì)純化等的技術(shù)路線。然而目前常用的供體質(zhì)粒如pFastBacHT只能滿足一般的重組蛋白表達,沒有信號肽序列,難于有效引導表達的外源蛋白分泌到胞外;另外,表達的蛋白由于N端含有較多的附加序列,從而有可能影響重組蛋白的表達效率和理化性質(zhì),并有

3、可能進一步影響其生物學活性。
　　 針對上述問題,為了滿足家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達蛋白的不同需要,我們將商品化質(zhì)粒pFastBacHT進行了如下改造:①將蛋白質(zhì)分泌信號肽序列插入到pFastBacHT供體質(zhì)粒中,使表達的重組蛋白能夠有效分泌到細胞外。通過基因操作技術(shù),將該桿狀病毒信號肽序列g(shù)p67 signal sequence重組入pFastBacHT供體質(zhì)粒中,得到了攜帶信號肽序列的供體質(zhì)粒,我們將之命名為pBacGP67a

4、,b,c。采用該供體質(zhì)粒,表達的蛋白質(zhì)就能夠有效分泌到細胞外,從而有利于外源蛋白的分離純化;②切除供體質(zhì)粒pFastBacHT多克隆位點前冗長的附加序列,減少對外源重組蛋白的影響。將pFastBacHT供體質(zhì)粒多克隆位點前的TEV序列刪除,使重組蛋白的N端僅融合為方便重組蛋白純化而設計的6×His序列。改造后的質(zhì)粒命名為pFastShorta,b,c。
　　 利用上述構(gòu)建的供體質(zhì)粒并利用家蠶Bac-to-Bac表達系統(tǒng),構(gòu)建了表

5、達新型抗癌基因工程抗體基因(T2融合蛋白)的重組病毒。分別在家蠶細胞和家蠶幼蟲內(nèi)進行了表達,分析了重組蛋白的表達規(guī)律,并利用親和層析技術(shù)純化了該重組蛋白。生物活性檢測結(jié)果表明,家蠶幼蟲中表達的T2蛋白具有較好的生物學活性,說明利用家蠶能夠成功表達抗腫瘤蛋白。
　　 本研究的意義在于:①通過對商品化供體質(zhì)粒pFastBacHT的改造,開發(fā)了兩種不同用途的供體質(zhì)粒,便于重組蛋白的分泌、表達和純化,以滿足不同目的的需要。②利用家蠶Ba