SF-納米HA復(fù)合材料的制備及其與BMSCs相容性的實驗研究.pdf

1、前言：
　　組織工程技術(shù)的發(fā)展為應(yīng)對日漸增多的骨病、骨外傷和骨缺陷所帶來的挑戰(zhàn)提供了新的希望。天然骨是一種復(fù)雜和分層的有機礦化組織，由膠原纖維和均勻分布的羥基磷灰石(Hydroxyapatite HA)有機結(jié)合而成。高度有機的納米纖維蛋白（主要是Ⅰ型膠原蛋白）不但為鈣化組織提供不可或缺的三維支架結(jié)構(gòu)，而且對HA顆粒有規(guī)律的立體化沉積有誘導(dǎo)作用。因此，在骨組織工程理論背景下，開發(fā)在化學(xué)上和結(jié)構(gòu)上模仿天然骨的細胞外基質(zhì)的納米纖維結(jié)構(gòu)的

2、復(fù)合支架，具有廣闊的前景。
　　羥基磷灰石(HA)是骨組織的主要無機成分，由于其具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性以及便于裝配的特性，已被用作替代骨組織的生物材料。HA，特別是納米尺寸的HA（納米HA），有更高的生物活性。不僅為骨傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)黏附和骨再生提供了良好的微環(huán)境，也可作為生物種植應(yīng)用的誘導(dǎo)劑和藥物遞送的載體系統(tǒng)。有報道用濕化學(xué)沉淀法、溶膠-凝膠合成法、共沉淀法、水熱合成法、機械化學(xué)合成法、微波處理以及其他方法制備納米HA。納

3、米HA顆粒的形狀和尺寸的均一性對于以其組織工程產(chǎn)品和藥物釋放系統(tǒng)應(yīng)用是至關(guān)重要的，也是納米HA合成的關(guān)鍵。水分散性是在納米HA生物應(yīng)用中提出的。對此進行了許多實驗，包括機械攪拌、超聲波能量輸入和檸檬酸根離子修飾。遺憾的是，這些方法要么只能為納米HA提供暫時分散性，要么會損害其納米結(jié)構(gòu)和生物相容性。自然的生物礦化過程是最常用制備納米HA的方法之一，其能提供滿意的納米結(jié)構(gòu)和生物相容性。絲素蛋白(Silk Fibroin SF)，一個有β-折

4、疊結(jié)構(gòu)的線性多肽，具有調(diào)節(jié)生物礦化以及調(diào)節(jié)納米HA成核和調(diào)節(jié)生長功能的天然蛋白。已知在不同條件下使用SF作為模板產(chǎn)生的納米HA顆粒具有不同的形態(tài)，但如何以SF為模板制備尺寸均一的水分散性納米HA迄今未見報道。正是由于在水溶液中，SF能自身聚集成不同尺寸和形狀的微粒，從而給HA的礦化提供了非均質(zhì)模板。絲素蛋白與HA結(jié)合形成的復(fù)合支架可以提高支架的生物醫(yī)學(xué)特性。最常用的制造SF/HA復(fù)合材料方法是把HA粉末與絲素溶液混合。這會導(dǎo)致復(fù)合材料中

5、HA顆粒分布不均勻、顆粒相分離和有限的HA顆粒濃度。
　　針對上述情況，本實驗以絲素蛋白和鈣磷溶液為原料，通過調(diào)節(jié)SF的自身聚集，獲得均一的納米SF模板，并以此模板調(diào)節(jié)HA生物礦化過程，得到大小均勻的水分散性納米HA。最終構(gòu)建成優(yōu)化的SF/納米HA復(fù)合材料，其在結(jié)構(gòu)和組成上與天然骨組織相似。然后又采用形態(tài)學(xué)、qReal-time PCR以及酶檢測等方法對該復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)融合的細胞相容性進行了檢測，為探索一

6、種可應(yīng)用于骨組織工程，滿足臨床需求新型的骨修復(fù)材料奠定實驗基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　以氫氧化鈣[Ca(OH)2]和磷酸(H3PO4)為原料，絲素蛋白作為調(diào)控納米HA生長的模板，通過濕沉淀法合成不同SF/HA比例的SF/納米HA復(fù)合材料。通過使用原子力顯微鏡(AFM)、納米粒度系統(tǒng)動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)、透射電鏡(TEM)、X射線衍射(XRD)、傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR)、熱重分析儀(TGA)和掃描電子顯微鏡(SEM

7、)檢測復(fù)合材料的微觀形貌、化學(xué)結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性等。
　　基于骨組織的結(jié)構(gòu)特性，我們選擇了不規(guī)則聚集的納米HA顆粒(SF與HA的質(zhì)量比為3∶7)和單分散納米HA顆粒(SF與HA的質(zhì)量比為8∶2)制備支架作為研究對象。采用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，將BMSCs接種在復(fù)合支架上進行共培養(yǎng)，用激光共聚焦掃描顯微鏡及SEM觀察細胞在支架上的黏附及增殖情況。對堿性磷酸酶、鈣離子含量進行測定，分析BMSCs分泌細胞外鈣基質(zhì)的能力。用(q)Real-tim

8、ePCR、免疫組化染色等方法檢測BMSCs成骨與骨化的能力。
　　實驗結(jié)果：
　　通過AFM、納米粒度系統(tǒng)動態(tài)光散射技術(shù)和TEM觀察，結(jié)果顯示，熱處理后獲得了均勻的SF納米顆粒。SF顆粒的橫向尺寸為20±0.9nm(N=300)，SF納米顆粒的高度為5±0.5nm。不同濃度SF溶液配制的納米HA顆粒的形態(tài)和水穩(wěn)定性存在差異。隨著SF濃度的增加，納米HA顆粒的形態(tài)逐漸從針狀變成米粒狀，當(dāng)SF/HA低于5∶5時觀察到不規(guī)則的針狀

9、納米顆粒聚集在一起，當(dāng)SF/HA高于7∶3時觀察到棒狀的單分散性納米HA顆粒（長約150-200nm，寬約65nm）。隨著SF含量的增加，HA在水溶液中由沉積狀態(tài)變?yōu)榉稚⒌臓顟B(tài)。XRD、FTIR和TGA檢測結(jié)果顯示，沒有其他磷酸鈣相的HA晶體的存在，同時SF存在于納米HA顆粒中。用TEM和SEM分別觀察不同溫度和不同pH處理的SF/納米HA顆粒，結(jié)果進一步證實，SF存在于HA顆粒內(nèi)部和表面，并且表面的SF在顆粒的水分散性中具有重要作用，

10、同時pH值對納米HA顆粒的水分散性也有重要的影響。
　　SEM觀察支架內(nèi)的顆粒微觀結(jié)構(gòu)和HA的分散度的結(jié)果顯示，單分散納米HA顆粒均勻地分布在復(fù)合支架中，支架孔壁的納米纖維直徑為20-100nm，其形態(tài)類似于天然細胞外基質(zhì)中的納米結(jié)構(gòu)。共聚焦顯微鏡、SEM和DNA含量檢測評估BMSCs與不同支架組織相容性結(jié)果顯示，分散性好的與分散性差的SF/納米HA支架內(nèi)的BMSCs都增殖，但在有良好分散性的納米HA顆粒的支架中細胞的增殖率要高于

11、聚集的納米HA顆粒支架。同時，較高含量納米HA顆粒的支架具有較高的細胞相容性。堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)和鈣含量的定量分析結(jié)果均顯示具有:良好分散性和較高HA含量的支架組始終表現(xiàn)出增高的ALP水平和增多的鈣沉積。Runx2、骨鈣素(Osteocalcin OC)基因的表達以及Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色等結(jié)果顯示，良好分散性的HA支架能顯著誘導(dǎo)Runx2基因、OC基因和Ⅰ型膠原蛋白的表達。綜上所述，S