阿托伐他汀致膽汁淤積型肝毒性機制研究.pdf

1、目的：通過考察阿托伐他汀、2-羥基阿托伐他汀酸、4-羥基阿托伐他汀酸對轉(zhuǎn)運蛋白Bsep(bile salt export pump，膽鹽輸出泵)、Mrp2(multidrug resistance associated protein2，多藥耐藥相關(guān)蛋白2)功能的影響，探討藥物及其代謝物對肝細胞內(nèi)膽汁相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的影響，從而研究藥物引起膽汁淤積型肝毒性可能的機制。
　　方法：⑴使用兩步灌流法獲得原代肝細胞，臺盼藍染色法選用細胞活性

2、達85％以上的肝細胞用于后續(xù)試驗。在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中，肝細胞無法較好的保持其極性和代謝功能，而“三明治”培養(yǎng)法可以解決這些問題。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，肝細胞間形成緊密連接的膽小管網(wǎng)絡(luò)，肝細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運蛋白也會表達在相應(yīng)的細胞膜側(cè)。⑵分離得到的大鼠原代肝細胞采用10％血清的完全培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)24h，用MTT法分別考察曲格列酮、MK-571、阿托伐他汀、2-羥基阿托伐他汀酸、4-羥基阿托伐他汀酸的毒性，考察藥物對原代細胞的毒性作用為下一步細胞

3、實驗做準備。⑶用阿托伐他汀、2-羥基阿托伐他汀酸、4-羥基阿托伐他汀酸、曲格列酮、MK-571作用于構(gòu)建的原代大鼠肝細胞模型。CFDA(5-(and6) Carboxy-2，7-dichlorofluorescein diacetate，5(6)-羧基-2，7-二氯熒光素雙乙酸鹽）、TCA(taurocholic acid，牛磺膽酸)分別為Mrp2和Bsep底物，使用酶標儀檢測細胞內(nèi)CDF(5(and6)-carboxy-2，7-dic

4、hlorofluorescein，5(6)-羧基2，7-二氯熒光素）熒光強度，考察待測物對Mrp2蛋白的影響，收集細胞裂解液樣本使用LC-MS/MS測定TCA在細胞內(nèi)外的濃度，用含Ca2+/Mg2+和不含Ca2+/Mg2+中底物濃度計算出膽汁清除率BEI評價藥物對Mrp2、Bsep的轉(zhuǎn)運蛋白功能的影響。⑷建立LC-MS/MS測定TCA的方法，用LC-MS/MS測定細胞裂解液中TCA的濃度，考察給藥組和對照組Bsep蛋白轉(zhuǎn)運TCA的差異。

5、
　　結(jié)果：①平均體重約200g的SD大鼠經(jīng)兩步灌流法獲得原代肝細胞，用臺盼藍拒染法檢測肝細胞存活率，成活率在85％以上細胞培養(yǎng)24 h，待大部分細胞貼壁后改用無血清培養(yǎng)基。②MTT結(jié)果顯示曲格列酮、MK-571、阿托伐他汀及其兩種活性代謝物對原代肝細胞的毒性作用呈時間依賴性和濃度依賴性。6h的MTT毒性試驗結(jié)果顯示藥物各濃度均無明顯毒性。12h毒性試驗結(jié)果顯示，MK-571低中高濃度均無顯示毒性，曲格列酮作為典型肝毒性藥物低濃度

6、(10μmol/L)無明顯毒性。24h毒性實驗結(jié)果顯示MK-571、阿托伐他汀及其活性代謝物，4種化合物在低中濃度無明顯毒性。由于轉(zhuǎn)運實驗中藥物作用細胞時間較短，因此曲格列酮選取低濃度，其他藥物系列工作液均選取低中高濃度。③阿托伐他汀、2-羥基代謝物增加了TCA在細胞內(nèi)的蓄積量，并且同時降低了BEI值，說明它們抑制了由Bsep介導(dǎo)的TCA從肝細胞排泄的過程。阿托伐他汀和2-羥基代謝物增加細胞內(nèi)CDF(由Mrp2轉(zhuǎn)運的底物)蓄積量，降低了