2型PUFAs代謝異常與相關基因多態(tài)性及過氧化物酶體β-氧化關系的研究.pdf

1、2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，DM)是由于胰島素相對缺乏或胰島素抵抗(insulin resistance，IR)而引起的代謝紊亂性疾病，可導致多器官功能損害。近年來，其發(fā)病率逐年升高，已成為嚴重威脅人們健康的全球性疾病。因此，深入了解其發(fā)病機制，對于2型糖尿病的預防及治療有著重要意義。
　　脂肪酸代謝紊亂已被公認為是2型糖尿病的一個重要特征，2型糖尿病時，各種脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪酸，如何改變？

2、與2型糖尿病的關系如何？卻研究甚少。
　　相關基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是從基因水平影響體內(nèi)脂肪酸代謝的重要因素，并且與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關。有研究表明，為多不飽和脂肪酸合成過程中關鍵酶，△5去飽和酶(△5 desaturase，△5D)和△6去飽和酶(△6 desaturase，△6D)編碼的基因—脂肪酸去飽和酶1(fatty acid desaturas

3、e1，F(xiàn)ADS1)和2(FADS2)基因的SNPs突變與體內(nèi)脂肪酸關系密切，那么FADS基因簇的SNP突變是否與2型糖尿病時脂肪酸代謝紊亂有關？
　　而且，除了基因多態(tài)性能夠影響體內(nèi)脂肪酸代謝以外，體內(nèi)參與脂肪酸代謝的相關酶的表達及活性也是影響脂肪酸代謝的重要因素。肝臟是體內(nèi)脂肪酸合成的主要器官，也是為肝外組織提供脂肪酸的主要器官。2型糖尿病時，肝臟脂肪酸的合成又會發(fā)生哪些改變？與2型糖尿病時的脂肪酸代謝紊亂關系如何？值得進一步研

4、究。
　　因此，本研究首先對2型糖尿病患者血清中脂肪酸譜進行檢測及分析，以了解2型糖尿病患者體內(nèi)脂肪酸變化情況，選出與2型糖尿病關系密切的脂肪酸作為研究的靶點，從基因水平以及肝臟對脂肪酸合成影響角度深入探討2型糖尿病時脂肪酸代謝紊亂的機制，為2型糖尿病的預防和治療提供有力的實驗證據(jù)。
　　第一部分、2型糖尿病患者血清脂肪酸譜分析
　　目的:了解2型糖尿病患者體內(nèi)脂肪酸代謝改變情況，為研究2型糖尿病時脂肪酸代謝紊亂機制尋

5、找靶點。
　　方法:選擇符合條件的研究對象共752例，按照病例對照研究分組（健康人421例，2型糖尿病患者331例），收集空腹血清，測定空腹血糖(fastingblood glucose，F(xiàn)BG)、胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INs）、甘油三酯(triglycerides，TGs)、膽固醇(total cholesterol，TC)及總游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)，計算體重指數(shù)（body

6、mass index，BMI）;用高效氣相色譜法測定所有受試者空腹血清中主要的14種脂肪酸，并進行分類分析，以了解2型糖尿病患者體內(nèi)脂肪酸代謝情況。
　　結果:
　　1.一般情況及生化指標2型糖尿病（DM組）與健康非糖尿病組（Con組）的性別比例一致，沒有差異。與Con組相比，DM組的年齡64(10) vs.51.38(18)，明顯高于Con組，P＜0.001; DM組的BMI(25.568±3.316 vs.23.177±

7、2.434)同樣明顯增加，P＜0.001。
　　與Con組相比，DM組FBG、FINs、TC及TGs均明顯增高，P＜0.001;通過公式計算得DM組的胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive index，ISI)明顯下降，而胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)則明顯增加，P＜0.001。血清總FFAs明顯增加，（403.39±82.54μmol/L vs.658.62±125.75μmol/L），P＜0.001。
　　

8、2.血清脂肪酸譜脂肪酸譜顯示:與Con相比，DM組血清中C16∶0、C16∶1n-7、C18∶1n-9、C18∶3n-3(α-linolenic acid, ALA)、C20∶5n-3(eicosapentaenoic acid, EPA)、C22∶5n-3(docosapentaenoic acid, DPA)及C20∶4n-6(arachidonic acid, AA)百分含量明顯增加，P＜0.01;C18∶0、C24∶0、 C22

9、∶6n-3(docosahexenoic acid,DHA)和C18∶2n-6(linoleic acid, LA)的百分含量明顯下降，P＜0.01;只有C20∶0、C22∶0和C22∶4n-6變化不明顯。
　　對各種脂肪酸進行歸類分析，發(fā)現(xiàn):與Con組相比，DM組的總單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFAs)所占比例明顯升高，P＜0.01;而總飽和脂肪酸（saturated fatty

10、acid, SFAs），總n-3系多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，n-3PUFAs)和總n-6系多不飽和脂肪酸(n-6PUFAs)均沒有明顯變化。
　　小結:
　　1.2型糖尿病患者體內(nèi)總游離脂肪酸增加。
　　2.2型糖尿病患者血清脂肪酸譜發(fā)生明顯改變，AA含量明顯增加，DHA的含量明顯下降。
　　第二部分、FASDS1-FADS2基因簇單核苷酸多態(tài)性與血清PUFAs、去飽

11、和酶活性及2型糖尿病的關聯(lián)性研究
　　目的:探討FADS1-FADS2基因簇的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)與2型糖尿病患者血清PUFAs及2型糖尿病之間的相關性。
　　方法:選擇符合條件的研究對象752例（入選和排除標準同第一部分研究），收集外周血，提取DNA，用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix Assisted Laser Desorption/ioni

12、zation Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS)實驗平臺進行DNA的SNPs分型。用非條件Logistic回歸逐一分別在未校正混雜因素;校正性別和年齡;校正性別、年齡和BMI時，分析rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616四個SNP位點與2型糖尿病患者血清PUFAs、去飽和酶活性以及2型糖尿病發(fā)病風險的相關性。
　　結果:
　　1.按照基

13、因型分析血清PUFAs的含量及去飽和酶活性
　　1.1 rs174545位點突變對血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs174545(C＞G)位點攜帶G基因型的個體血清LA的相對含量增加，AA的含量相對降低;在2型糖尿病患者中，rs174545(C＞G)位點攜帶G基因型的個體不僅血清LA相對含量增加，AA相對含量降低,還出現(xiàn)了EPA與DPA相對含量的下降(P＜0.05)。另外，rs174545(C＞G)位點攜帶G基因型

14、還可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA和EPA/ALA的比值下降(P＜0.05)。
　　1.2 rs2072114位點突變對血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs2072114(A＞G)位點攜帶G基因型的個體血清AA的含量相對降低;在2型糖尿病患者中，rs2072114(A＞G)位點攜帶G基因型的個體不僅血清LA相對含量增加，AA相對含量降低，還出現(xiàn)了EPA與DPA相對含量的下降(P＜0.05)。另外，rs20

15、72114(A＞G)位點攜帶G基因型還可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA和EPA/ALA的比值下降（P＜0.05）。
　　1.3 rs174602位點突變對血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs174602(A＞G)位點攜帶G基因型的個體血清LA的含量相對增加，AA和EPA的含量相對降低;在2型糖尿病患者中，rs174602(A＞G)位點攜帶G基因型的個體不僅血清LA相對含量增加，AA相對含量降低，還出現(xiàn)了D

16、PA相對含量的下降（P＜0.05）。另外，rs174602(A＞G)位點攜帶G基因型還可以使健康人血清中AA/LA和EPA/ALA，及2型糖尿病患者組血清中EPA/ALA比值下降(P＜0.05)。
　　1.4 rs174616位點突變對血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs174616(C＞T)位點攜帶T基因型的個體血清AA含量相對降低，對其他PUFAs沒有影響;在2型糖尿病患者中，rs174616(C＞T)位點攜帶T

17、基因型的個體血清LA相對含量增加(P＜0.05)，對其他PUFAs也沒有影響。另外，rs174616(C＞T)位點攜帶T基因型還可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA的比值下降(P＜0.05)。
　　以上結果說明:rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616均可以影響健康人和2型糖尿病患者體內(nèi)的PUFAs含量與AA/LA和（或）EPA/ALA的比值，其中rs174616只對n-6系PUFAs的代謝

18、有影響。另外，同一種突變因素在健康人和2型糖尿病體內(nèi)引起的表現(xiàn)不同。
　　2.FADS1-FADS2基因簇的SNP突變與2型糖尿病發(fā)病風險的相關性研究
　　2.1 Logistic回歸分析（未剔除混雜因素）
　　結果顯示:rs174616C＞T與2型糖尿病的發(fā)病風險存在著負相關。在共顯性模型下，與攜帶rs174616CC基因型的個體比較，攜帶rs174616CT和rs174616TT基因型的個體發(fā)生2型糖尿病的風險降低

19、，OR值分別為0.708(95％CI=0.508,0.987, P=0.041)和0.720(95％CI=0.521,0.985,P=0.043);在顯性模型下，與攜帶rs174616CC基因型的個體比較，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個體發(fā)生2型糖尿病的風險降低，OR值為0.717（95％CI=0.518，0.992，P=0.042）;而在隱性模型下，與攜帶rs174616(CC+CT)基因型的個體比較，攜帶rs17461

20、6TT基因型的個體發(fā)生2型糖尿病的風險沒有變化。
　　rs174545，rs2072114和rs174602，與2型糖尿病的發(fā)病風險無關。以健康者為對照組，以2型糖尿病為病例組，在3種模型下差異均無統(tǒng)計學意義。
　　2.2 調(diào)整性別與年齡（調(diào)整1）
　　結果顯示:在調(diào)整性別與年齡之后，rs174616C＞T與2型糖尿病的發(fā)生率仍成負相關。在共顯性模型下，攜帶rs174616CT和rs174616TT基因型的個體比攜帶r

21、s174616CC基因型的個體，發(fā)生2型糖尿病的風險降低，OR值為0.628(95％CI=0.437,0.901,P=0.011)和0.619(95％CI=0.441,0.889，P=0.010);在顯性模型下，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個體比攜帶rs174616CC基因型的個體發(fā)生2型糖尿病的風險降低，OR值為0.630(95％CI=0.442，0.897，P=0.01);在隱性模型下，rs174616的基因型與2型糖

22、尿病發(fā)病仍然無關。
　　調(diào)整性別與年齡后，其他3個位點:rs174545，rs2072114和rs174602仍與2型糖尿病的發(fā)病風險無關。
　　2.3 調(diào)整性別、年齡和BMI（調(diào)整2）
　　結果顯示:在調(diào)整性別、年齡與BMI之后，rs174616C＞T與2型糖尿病的發(fā)生率仍成負相關。在共顯性模型下，攜帶rs174616CT和rs174616TT基因型的個體比攜帶rs174616CC基因型的個體，發(fā)生2型糖尿病的風險降

23、低，OR值為0.656(95％CI=0.447，0.964，P=0.032)和0.652(95％CI=0.440，0.931，P=0.020);在顯性模型下，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個體比攜帶rs174616CC基因型的個體發(fā)生2型糖尿病的風險降低，OR值為0.646（95％CI=0.443，0.943，P=-0.023）;在隱性模型下，rs174616的基因型與2型糖尿病發(fā)病仍然無關。
　　調(diào)整性別、年齡和BM

24、I后，其他3個位點:rs174545，rs2072114和rs174602仍與2型糖尿病的發(fā)病風險無關。
　　以上結果說明，在排除了性別、年齡和BMI的干擾后，攜帶突變型基因rs174616(CT+TT)的個體比攜帶野生型基因rs174616CC的個體，發(fā)生2型糖尿病的風險下降，即該位點的突變是2型糖尿病發(fā)病的保護因素。而rs174545，rs2072114和rs174602三個位點的突變則與2型糖尿病的發(fā)病風險無關。
　　

25、3.按照顯性模型分析rs174616位點SNP突變對血清PUFAs及去飽和酶活性的影響為了進一步探討rs174616與2型糖尿病患者血清PUFAs代謝的關系，接下來我們按照rs174616CC和rs174616(CT+TT)基因型分別對健康非糖尿病患者和2型糖尿病患者血清PUFAs含量，以及AA/LA和EPA/ALA的比值進行了分析。結果顯示:在健康人，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個體比攜帶rs174616CC基因型的個體

26、AA/LA的比值下降;在2型糖尿病患者中。攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個體比攜帶rs174616CC基因型的個體LA含量增加，AA/LA比值下降。另外，rs174616位點突變對n-3系PUFAs及EPA/ALA均沒有影響。
　　小結:
　　1.在中國北方漢族人群中，F(xiàn)ADS1-FADS2基因簇中rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616四個突變位點都能降低健康人和2型糖尿病患者△

27、5D和△6D的活性，從而影響血清中LA、AA和EPA的含量，而對ALA和DHA的含量沒有影響。
　　2.在中國北方漢族人群中，F(xiàn)ADS1-FADS2基因簇中rs174616位點突變與2型糖尿病的發(fā)生呈負相關，即攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個體2型糖尿病的發(fā)病風險明顯下降，可能與rs174616(CT+TT)基因型能夠降低體內(nèi)AA的合成有關。
　　第三部分、過氧化物酶體β-氧化活性增強與2型糖尿病大鼠肝臟DHA合

28、成增加有關
　　目的:從肝臟合成脂肪酸角度探討2型糖尿病時DHA變化的機制。
　　方法:用高脂飲食加小劑量鏈脲左菌素(streptozotocin，STZ)的方法誘導2型糖尿病大鼠模型，檢測2、型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸譜;△5去飽和酶(△5-desaturase，△5D)和△6去飽和酶(△6D)表達水平;過氧化物酶體β氧化活性和相關酶的表達及DHA合成活性等方面去研究肝臟DHA合成情況，為尋找2型糖尿病時體內(nèi)DHA改變的原因提

29、供實驗依據(jù)。
　　結果:
　　1.2型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸譜由于食用的是高脂飲食，與Con組大鼠相比，2型糖尿病大鼠肝臟中C18∶0和C18∶1n-9（高脂飲食中主要的脂肪酸）明顯增加;SFAs/PUFAs的比值增高，而長鏈飽和脂肪酸C24∶0則明顯降低。另外，與Con組大鼠相比，2型糖尿病大鼠肝臟中絕大多數(shù)的PUFAs(ALA、LA、AA、EPA和DPA)和總PUFAs都明顯下降，但是我們卻意外的發(fā)現(xiàn)DHA和C22∶4n-

30、6明顯增加，幾乎是Con組的2倍;而且2型糖尿病大鼠肝臟DHA/ALA的比值也增加了，大約是Con組的5倍。因此，以上結果提示，2型糖尿病大鼠肝臟DHA的含量增加，增加的DHA可能是由于在合成增加引起的。
　　2.2型糖尿病大鼠肝臟DHA合成過程中關鍵酶的表達為了進一步研究2型糖尿病大鼠肝臟DHA增多與DHA合成代謝的關系，我們檢測了DHA合成過程中關鍵酶的表達，結果顯示:與Con組相比，2型糖尿病大鼠肝臟△5D和△6D的mRNA

31、和蛋白質表達水平均下降，而過氧化物酶體β氧化過程中的酶直鏈脂酰CoA氧化酶(straight-chainacyl-CoA oxidase，SCOX)、D雙功能蛋白(D-bifunctional protein，DBP)和3-酮脂酰CoA硫解酶（3-Ketoacyl-CoA thiolase，THL）的表達增加。由此推斷，2型糖尿病大鼠肝臟DHA增多是由于過氧化物酶體階段β氧化增強引起的，而與內(nèi)質網(wǎng)階段的去飽和、延長反應無關。
　　

32、3.2型糖尿病大鼠肝臟過氧化物酶體β氧化階段DHA合成活性為了證實過氧化物酶體β氧化階段與2型糖尿病時肝臟DHA合成增多有關，首先，我們對2型糖尿病大鼠肝臟過氧化物酶體β氧化活性進行了測定。結果顯示過氧化物酶體β氧化活性增加。這一結果與此過程中的酶表達增加相符，也與前面的結果中提到2型糖尿病大鼠肝臟C24∶0含量下降一致，因為極長鏈脂肪酸C24∶0在體內(nèi)只能夠通過過氧化物酶體被氧化代謝。
　　接下來，我們用C24∶6n-3作為底物

33、,與肝組織勻漿共孵育，直接檢測過氧化物酶體β氧化階段DHA的合成。結果顯示:C24∶6n-3與肝組織勻漿共孵育4小時后，2型糖尿病大鼠肝臟增加的DHA和減少的C24∶6n-3均比對照組變化明顯。由此可見，2型糖尿病大鼠肝臟過氧化物酶體β氧化活性增加與DHA合成增強有關。
　　小結:
　　1.高脂飲食加小劑量STZ誘導的2型糖尿病大鼠肝臟絕大多數(shù)PUFAs明顯減少，而只有DHA含量增加。
　　2.2型糖尿病大鼠肝臟DHA

34、增加，增多的DHA與過氧化物酶體β氧化活性增強有關，而與內(nèi)質網(wǎng)△5和△6去飽和酶的表達下降無關。
　　結論:
　　1.2型糖尿病患者不僅存在血清總游離脂肪酸的增多，而且血清脂肪酸譜也發(fā)生了明顯變化，n-3系PUFAs中DHA的含量明顯下降;n-6系PUFAs中AA的含量明顯增加，LA的含量則明顯降低。
　　2.在中國北方漢族人群中，F(xiàn)ADS1-FADS2基因簇的rs174616(C＞T)位點SNP突變與2型糖尿病的發(fā)病