過氧化物酶體增殖物激活受體γ及其基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:腦梗死(ischemic stroke，IS)是繼惡性腫瘤、心臟病之后，導(dǎo)致全球人口死亡的三大原因之一。IS患者由于接受溶栓治療或栓子自發(fā)向遠(yuǎn)端推移而出現(xiàn)缺血后的再灌注進(jìn)一步加重了缺血后的腦損傷。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)激動(dòng)劑在腦缺血再灌注損傷中通過減少細(xì)胞凋亡及減少腦梗死體積等有效發(fā)揮腦保護(hù)作用。熊果酸(ursol

2、icAcid，UA)作為PPARγ激動(dòng)劑在過敏性哮喘中發(fā)揮抗炎作用，如若其能在腦缺血再灌注損傷過程中影響PPARγ的激活進(jìn)而調(diào)控炎癥因子水平，將有望為IS藥物治療提供新的思路。同時(shí)，PPARγ基因上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)rs1801282和rs3856806是重要的功能性SNP，可以通過影響血清PPARγ水平進(jìn)一步調(diào)節(jié)患者血糖及血脂水平，增加罹患動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的危險(xiǎn)。

3、
　　本研究通過大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞及再灌注(middle cerebral artery occasion andreperfusion，MCAO/R)模型和IS患者臨床實(shí)驗(yàn)研究PPARγ在IS急性期的作用及其分子機(jī)制并探討PPARγ基因多態(tài)性和中國人群IS的相關(guān)性。
　　研究方法:1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):250-280g清潔級(jí)健康雄性成年SD大鼠162只，參考Longa的線栓法制備MCAO/R模型，假手術(shù)組不插入線栓，其余操作相同。

4、UA處理組于缺血再灌注后0h、24h以及47.5h給予對(duì)應(yīng)劑量的UA灌胃。BADGE與UA聯(lián)合處理組于缺血再灌注后0h、24h以及47.5h后以UA灌胃及BADGE30mg/kg腹腔注射。再灌注后動(dòng)物蘇醒時(shí)以及48h后處死前根據(jù)Longa的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)分。模型成功48h后，行TTC染色計(jì)算腦梗死體積;尼氏染色及免疫組化染色檢測(cè)PPARγ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1;ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6,Weste

5、rn blot檢測(cè)PPARγ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1及NFκB和MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平α=0.05。2、臨床實(shí)驗(yàn):收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的IS患者895例以及中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者883例。收集臨床資料并留取病例組及體檢者的外周靜脈血，提取基因組DNA，利用SNaPshot技術(shù)進(jìn)行PPARγ基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs1801282及r

6、s3856806)分型。運(yùn)用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05被認(rèn)為有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):1)各組大鼠神經(jīng)功能損傷比較:再灌注48 h后，缺血再灌注組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。應(yīng)用UA干預(yù)后大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯改善（P＜0.01），聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較單一應(yīng)用UA組有明顯差異（P＜0.05），但較缺血再灌注組仍有明顯降低(P＜0.05)。2)各

7、組大鼠腦梗死體積比較:與缺血再灌注組相比，應(yīng)用UA可以明顯減少大鼠梗死體積(P＜0.01)，聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，大鼠的腦梗死體積較單一應(yīng)用UA組有明顯差異(P＜0.05)，但較缺血再灌注組仍有明顯減小(P＜0.05)。3)各組大鼠神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)比較:再灌注48h后，缺血再灌注組梗死區(qū)域尼氏染色可見完整神經(jīng)元個(gè)數(shù)較假手術(shù)組明顯減少(P＜0.01)，應(yīng)用UA干預(yù)后大鼠梗死區(qū)域內(nèi)完整神經(jīng)元個(gè)數(shù)明顯增多(P＜0.01);聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，

8、完整神經(jīng)元個(gè)數(shù)較單一應(yīng)用UA組有明顯差異(P＜0.05)，但較缺血再灌注組仍有明顯增加(P＜0.05)。4)各組大鼠腦組織中PPARγ表達(dá)水平比較:免疫組化及Western blot結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組腦組織內(nèi)的PPARγ功能及蛋白表達(dá)下降(P＜0.01)。UA干預(yù)組PPARγ功能及蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.01)。聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，PPARγ功能及蛋白表達(dá)與缺血再灌注組比較沒有顯著差異（P＞0.05）。5）各組大鼠

9、梗死腦組織中TNF-α、IL-1β、IL6的水平比較:ELISA結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內(nèi)的TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著增高(P＜0.01)。與缺血再灌注組相比，UA干預(yù)組梗死腦組織內(nèi)的TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低（5mg/kg組:P＜0.05;10mg/kg組及20mg/kg組:P＜0.01）。聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，梗死腦組織內(nèi)的TNF-α、IL-1β、IL-6水平較單一應(yīng)用UA組有

10、明顯差異(P＜0.05)，但與缺血再灌注組比較沒有顯著差異（P＞0.05）。6）各組大鼠梗死腦組織中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表達(dá)水平比較:免疫組化與Western blot結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內(nèi)的MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)增高(P＜0.01)，MMP-9的功能也增強(qiáng)(P＜0.01)。與缺血再灌注組相比，UA干預(yù)組MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），MMP-9的功能也減弱

11、P＜0.01）。聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)及MMP-9的功能與僅應(yīng)用UA組比較有明顯差異（P＜0.01），MMP-9的蛋白表達(dá)水平及功能較缺血再灌注組仍有明顯降低（P＜0.05）。免疫組化與Western blot結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內(nèi)的TIMP-1的蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。與缺血再灌注組相比，UA干預(yù)組TIMP-1的蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.01)。聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，TI

12、MP-1的蛋白表達(dá)與僅應(yīng)用UA組比較有明顯差異(P＜0.01)，較缺血再灌注組仍有明顯增高(P＜0.05)。7)各組大鼠IS組織中MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白: Western blot結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內(nèi)的ERK1/2、p38 MAPK、JNK磷酸化水平增高(P＜0.01)。與缺血再灌注組相比，UA干預(yù)組ERK1/2、p38 MAPK、JNK磷酸化水平下降(P＜0.01)。聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，ERK1/2、p

13、38 MAPK、JNK磷酸化水平較僅應(yīng)用UA組有明顯差異(P＜0.01)，但較缺血再灌注組仍有明顯增加(P＜0.01)。8)各組大鼠肺組織中NFκB信號(hào)通路相關(guān)蛋白:Western blot結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內(nèi)的NFκB、IκB磷酸化水平增加(P＜0.01);與缺血再灌注組相比，UA干預(yù)組NFκB、IκB磷酸化水平下降(P＜0.01)。聯(lián)合應(yīng)用BADGE后，NFκdB、IκB磷酸化水平較僅應(yīng)用UA組有明顯差異

14、(P＜0.01)，但較缺血再灌注組仍有明顯增加(P＜0.01)。
　　2、臨床實(shí)驗(yàn):1）所有研究對(duì)象的2個(gè)SNPs基因型在抽樣群體中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。2）PPARγ基因rs1801282位點(diǎn)多態(tài)性在IS與對(duì)照組的頻率分布:G等位基因頻率在病例組明顯高于對(duì)照組(P＜0.001)。攜帶G等位基因的個(gè)體發(fā)生IS的危險(xiǎn)經(jīng)過Logistic回歸分析校正各種混雜因素后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，發(fā)病危險(xiǎn)度增加到

15、1.844倍(OR=1.844，95％CI:1.286-2.645; P＜0.001)。PPARγ基因rs3856806與對(duì)照組的頻率分布:T位基因頻率在病例組明顯高于對(duì)照組(P=0.010)。攜帶T等位基因的個(gè)體發(fā)生IS的危險(xiǎn)經(jīng)過Logistic回歸分析校正各種混雜因素后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，發(fā)病危險(xiǎn)度增加到1.366倍(OR=1.366，95％CI:1.077-1.733; P=0.010)。3）PPARγ基因單倍型rs1801282-r

16、s3856806的單倍型在對(duì)照組與IS組中的分布頻率:G-T單倍型IS組中的分布頻率明顯高于對(duì)照組，攜帶G-T單倍型的個(gè)體，患IS的風(fēng)險(xiǎn)率增加至2.953倍(OR=2.953;95％CI:2.082-4.190;P＜0.001)。4) PPARγ基因rs1801282的G等位基因及rs3856806的T等位基因?qū)S存在相乘交互作用(OR=3.404;95％CI:1.631-7.102; P＜0.001)及相加交互作用(RERI=41.

17、705;95％CI:14.586-68.824; AP=0.860;95％CI:0.779-0.940; S=8.170;95％CI:3.772-17.697)，此時(shí)為協(xié)同作用。全部IS病例中歸因于rs1801282的G等位基因及rs3856806的T等位基因交互作用引起的病例占86.0％。5）PPARγ基因rs1801282的G等位基因的對(duì)IS的作用在rs3856806的T等位基因存在下有所增強(qiáng)(OR=8.001 vs OR=1.84

18、4)，rs3856806的T等位基因的對(duì)IS的作用在rs1801282的G等位基因存在下也有所增強(qiáng)(OR=2.546 vs OR=1.366)。
　　結(jié)論:1、MCAO/R模型顯示PPARγ的表達(dá)下調(diào)伴功能減弱，UA通過激活PPARγ調(diào)節(jié)MCAO/R的大鼠腦組織內(nèi)金屬蛋白酶失衡，減輕MCAO/R誘導(dǎo)的腦炎癥損傷，其可能機(jī)制是通過抑制NFκB及MAPK通路的磷酸化來實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。2、PPARγ基因rs1801282的G等位基因