肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)相關microRNAs的篩選驗證及分子機制研究.pdf

1、目的 MicroRNAs是近年來腫瘤分子標志物研究的熱點。本研究的目的是篩選并鑒定能夠用于肝癌肝移植術后預警腫瘤復發(fā)的microRNA分子標志物,并進一步研究這些microRNAs的生物學功能、靶基因及信號通路,為明確肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)的機制提供實驗理論依據(jù)。
　　方法應用Exqion human microRNA microarray分析5例肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)和5例未復發(fā)的原發(fā)肝細胞癌組織樣本的miRNAs差異表達譜,并

2、應用TaqmanqPCR驗證芯片結(jié)果。Kaplan-Meier和Cox比例風險模型分析差異表達的miRNAs與肝癌肝移植術后病人生存和腫瘤復發(fā)的關系。通過體外細胞學實驗,研究差異表達的miRNAs對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移與侵襲等生物學功能的影響。利用生物信息學靶基因預測(TargetScan and miRDB)結(jié)合western bolt及免疫組化等實驗,鑒定miRNAs的靶基因,并對其作用的信號通路進行相關研究,闡明差異表達的mi

3、RNAs在肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)中的生物學功能及分子機制。體內(nèi)實驗通過裸鼠皮下成瘤及尾靜脈注射肝癌轉(zhuǎn)移模型,探討肝癌復發(fā)相關miRNAs對體內(nèi)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的作用。
　　結(jié)果通過比較肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)和未復發(fā)組腫瘤microRNAs差異表達譜,得到18個腫瘤復發(fā)相關的microRNAs(Fold Change≥1.5,p＜0.05)。經(jīng)TaqmanqPCR在155例臨床肝癌肝移植術后原發(fā)肝癌樣本中對芯片篩選得到的表達差異最明顯

4、的6個miRNAs(Fold Change≥2:: miR-19a,miR-886-5p mig-126,miR-223,miR-24 and mig-147)進行驗證,與芯片結(jié)果完全一致。ROC(Receiver-operatingcharacteristic)分析發(fā)現(xiàn)這6個miRNAs都能以較高的敏感度和特異度區(qū)分肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)和未復發(fā)的原發(fā)肝癌。Kaplan-Meier和Cox比例風險模型生存分析提示,這6個miRNAs的

5、表達特征能夠作為獨立的因素預測病人生存率(P=0.020)和無瘤生存率(p＜0.001)。體外功能實驗發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-19a表達能夠明顯抑制肝癌細胞的增殖、侵襲及遷移,并明顯增加細胞的凋亡率。生物信息學靶基因預測結(jié)合Western Blot分析,提示SOX4可能為miR-19a的潛在靶基因;裸鼠皮下成瘤及肺轉(zhuǎn)移實驗證實上調(diào)miR-19a表達后能夠抑制肝癌細胞皮下成瘤及肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生;另外,下調(diào)miR-155表達,可明顯抑制肝癌細胞侵襲。