GABAB受體通過Gi-o蛋白不同亞基調(diào)節(jié)下游信號及功能研究.pdf

1、GABAB受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的代謝型受體，屬于C家族G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor, GPCR)。GABAB受體參與了多種神經(jīng)活動并扮演著非常重要的角色，其功能失調(diào)會導(dǎo)致癲癇、抑郁、痙攣、焦慮、藥物成癮和認(rèn)知損傷等多種神經(jīng)類疾病。最近研究表明，GABAB受體與脆性X染色體綜合征(fragile X syndrome,FXS)也密切相關(guān)，F(xiàn)XS是由于fmr

2、-1基因沉默導(dǎo)致脆性X智障蛋白(fragile Xmental retardation protein, FMRP)表達(dá)不足而引起的一種常見的遺傳性精神發(fā)育遲滯疾病。GABAB受體的激動劑baclofen在FXS動物模型和臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的治療效果。然而之前的很多研究大都集中在GABAB受體對FXS表型影響的研究上，對于GABAB受體下游信號通路如何調(diào)控FXS的具體分子機(jī)制并不清楚。
　　在本論文的第一部分研究中，利用體外培養(yǎng)

3、的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元為模型，發(fā)現(xiàn)特異性激活GABAB受體可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CREB的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)fmr-1基因的轉(zhuǎn)錄并且增加FMRP蛋白的表達(dá)。在此研究的基礎(chǔ)上，深入研究了GABAB受體介導(dǎo)的CREB激活分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)Gi/o蛋白的Gβγ亞基、PLC以及Ca2+、FAK均參與了GABAB受體介導(dǎo)的IGF-1R轉(zhuǎn)激活以及下游Akt、ERK1/2和CREB激活。通過使用IGF-1R特異性抑制劑、靶向IGF-1R的shRNA以及siRNA,

4、發(fā)現(xiàn)下游Akt、ERK1/2和CREB激活均受到明顯抑制。有意思的是，使用PKC抑制劑以及RNAi使PKC表達(dá)沉默后，卻發(fā)現(xiàn)IGF-1R，Akt和ERK1/2激活并不受抑制，然而卻可以抑制CREB的激活。表明GABAB受體可分別通過PKC依賴通路以及IGF-1R轉(zhuǎn)激活依賴的PI3K信號通路激活CREB。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)阻斷FAK、PKC或IGF-1R均能抑制GABAB受體介導(dǎo)的FMRP表達(dá)。研究首次發(fā)現(xiàn)了GABAB受體激活可以調(diào)控FMRP

5、蛋白表達(dá)，并闡明了其分子機(jī)制，為進(jìn)一步揭示GABAB受體治療FXS提供重要參考意義。
　　內(nèi)化和失敏是GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中廣泛存在的重要負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式。而關(guān)于GABAB受體內(nèi)化問題長期來都存在爭議，最初研究發(fā)現(xiàn)GABAB受體在膜上非常穩(wěn)定，配體刺激后并不能增強(qiáng)其內(nèi)化。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)GABAB受體存在組成型內(nèi)化，激動劑刺激可增加內(nèi)化受體快速再循環(huán)到膜上，然而具體的機(jī)制并不是很清楚。本課題組發(fā)現(xiàn)GABAB受體激活后可以通過G蛋白

6、的Giα亞基，而不是Gβγ亞基誘導(dǎo)小G蛋白Rap1的持續(xù)性激活，Rap1激活后可以招募至膜上與GABAB1亞基C末端最后7個氨基酸殘基(RVHLLYK)結(jié)合。在本論文第二部分的研究中，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)激活GABAB受體可以增加RapGAPII絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，Rap1激活可以加速內(nèi)化的GABAB受體重新回到細(xì)胞膜上。當(dāng)使用與GABAB1亞基C末端序列相同短肽(Pep)處理CGN細(xì)胞后，利用基于生物素標(biāo)記的pull-down技術(shù)發(fā)現(xiàn)bacl

7、ofen處理后GABAB受體內(nèi)化增加。同樣在GB1野生型或GB1ΔS953突變體與GB2共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，利用基于免疫熒光的內(nèi)化研究方法發(fā)現(xiàn)突變體在baclofen刺激后內(nèi)化量顯著增加。為了進(jìn)一步研究Rap1是如何調(diào)控內(nèi)化后的GABAB受體命運(yùn)，我們使用了不同的內(nèi)涵體marker來標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)破壞GABAB受體與Rap1的結(jié)合后，內(nèi)化的受體與早期內(nèi)涵體標(biāo)記物EEA-1共定位比例減少，而與溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP-1共定位比例增加