擬無(wú)枝酸菌轉(zhuǎn)化洛伐他汀為無(wú)錫他汀的發(fā)酵優(yōu)化及無(wú)錫他汀的初步提取.pdf

1、他汀類(lèi)藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A(HMG—CoA)還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物，也是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。無(wú)錫他汀(本實(shí)驗(yàn)室擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán))是一種新型HMG—CoA還原酶抑制劑，由洛伐他汀經(jīng)擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsissp.ST2710)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。本論文主要對(duì)Amycolatopsissp.ST2710轉(zhuǎn)化洛伐他汀為無(wú)錫他汀的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，并對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物無(wú)錫他汀分離提取進(jìn)行初步探索。 首先，在搖瓶水平上研

2、究發(fā)酵條件對(duì)Amycolatopsissp.ST2710菌體形態(tài)、洛伐他汀轉(zhuǎn)化率的影響。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基初始pH值、裝液量、接種方式、接種量和搖床轉(zhuǎn)速等因素對(duì)菌體形態(tài)影響的考察。結(jié)果表明，當(dāng)菌絲球大小較均勻，菌球?yàn)橹睆?.5～0.7mm時(shí)有利于洛伐他汀的轉(zhuǎn)化。故剪切力的大小是影響洛伐他汀的轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。同時(shí)，考察了洛伐他汀溶液對(duì)Amycolatopsissp.ST2710生長(zhǎng)的影響，洛伐他汀臨界抑制濃度為1.5g/L，洛伐他汀添加濃度

3、以1.0g/L為宜；洛伐他汀轉(zhuǎn)化的適宜溫度為28℃，與菌體生長(zhǎng)期的最適溫度一致；經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH7.0～8.0、裝液量25mL/250mL三角瓶、接種方式為孢子接種、接種量10％、搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，無(wú)錫他汀的產(chǎn)量可達(dá)0.48g/L。 根據(jù)搖瓶水平分批發(fā)酵最優(yōu)條件，對(duì)菌株Amycolatopsissp.ST2710進(jìn)行5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵試驗(yàn)。分別考察攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)溶氧、菌體量、菌體形態(tài)和洛伐他

4、汀轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速為300r/min時(shí)能提供充足的氧氣使細(xì)胞快速生長(zhǎng)；而較低的轉(zhuǎn)速(200r/min)能在轉(zhuǎn)化階段減少泡沫的產(chǎn)生，有利于洛伐他汀的轉(zhuǎn)化。基于不同攪拌轉(zhuǎn)速下的洛伐他汀轉(zhuǎn)化率的變化情況，提出了分階段攪拌轉(zhuǎn)速控制策略：第一階段，菌體生長(zhǎng)期攪拌轉(zhuǎn)速300r/min；第二階段，洛伐他汀轉(zhuǎn)化期攪拌轉(zhuǎn)速200r/min。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用攪拌轉(zhuǎn)速控制策略，菌體生長(zhǎng)末期，菌體量達(dá)4.02g/L，至轉(zhuǎn)化結(jié)束時(shí)，無(wú)錫他汀產(chǎn)量達(dá)0.5

5、0g/L，發(fā)酵周期為80h，比搖瓶發(fā)酵縮短了16h。為有效減緩底物洛伐他汀的抑制，進(jìn)行了5L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵研究。對(duì)洛伐他汀采用補(bǔ)料分批發(fā)酵，產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)1.21g/L，與未補(bǔ)料發(fā)酵相比產(chǎn)量提高1.4倍。 此外，從5種樹(shù)脂中篩選出HP20樹(shù)脂，對(duì)發(fā)酵液中無(wú)錫他汀進(jìn)行分離提取，考察了HP20樹(shù)脂的吸附、解吸效果及影響因素。靜態(tài)實(shí)驗(yàn)表明，非極性樹(shù)脂HP20對(duì)無(wú)錫他汀的吸附容量為89.89mg(無(wú)錫他汀)/g(干樹(shù)脂)，最佳吸附pH為7.