脂肪干細(xì)胞復(fù)合SDF-1-雙層PLGA支架修復(fù)軟骨缺損的研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)負(fù)重和運(yùn)動(dòng)中起著十分重要的作用，同時(shí)它也是關(guān)節(jié)內(nèi)骨折中最易損傷的結(jié)構(gòu)。成熟的軟骨細(xì)胞特別是透明軟骨細(xì)胞再生能力較弱，一旦軟骨細(xì)胞受到破壞將加速軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生，形成局部軟骨缺損，易出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎，引發(fā)疼痛、關(guān)節(jié)畸形及殘疾，嚴(yán)重影響患者的健康和生活。目前臨床上采用了多種方法治療軟骨缺損，但治療效果尤其是長(zhǎng)期效果不穩(wěn)定。近年來(lái)，組織工程技術(shù)的發(fā)展，為解決軟骨損傷的修復(fù)這一難題提供了可能性，來(lái)源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞被用于組

2、織工程修復(fù)的種子細(xì)胞，其中脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)因其來(lái)源廣泛、在機(jī)體內(nèi)性能和含量穩(wěn)定、對(duì)機(jī)體損傷很小、培養(yǎng)條件較簡(jiǎn)單、增殖能力較強(qiáng)等特點(diǎn)，日益受到學(xué)者們的關(guān)注。干細(xì)胞被證實(shí)可向機(jī)體受損部位遷移，這種遷移活動(dòng)與多種趨化因子密切相關(guān)?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其它相關(guān)的間皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌的一種趨化蛋白，是已知的干細(xì)胞遷移的主要趨化因子，在

3、干細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢起了關(guān)鍵性的作用。SDF-1的生物學(xué)功能復(fù)雜，廣泛參與細(xì)胞發(fā)育、調(diào)控干細(xì)胞的遷移并與惡性腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最近的研究顯示，與SDF-1野生型小鼠相比，SDF-1-/-小鼠胚胎的肱骨長(zhǎng)度明顯短縮，組織學(xué)分析表明，SDF-1在肥大前期和肥大期的軟骨細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，說(shuō)明SDF-1在調(diào)控軟骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程中也扮演著十分重要的作用。我們認(rèn)為，SDF-1的上述對(duì)于細(xì)胞誘導(dǎo)趨化及對(duì)軟骨細(xì)胞分化調(diào)控的作用使得其在軟骨缺損再生修

4、復(fù)中可能存在有廣闊的應(yīng)用空間，因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了此項(xiàng)研究。本課題擬將SDF-1整合至PLGA支架中，使其在體內(nèi)局部釋放，然后復(fù)合脂肪來(lái)源的干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損，SDF-1可以使移植和體內(nèi)來(lái)源的干細(xì)胞遷移至缺損部位，從而促進(jìn)軟骨再生，同時(shí)采用熒光標(biāo)記示蹤移植的ADSCs。實(shí)驗(yàn)分為三部分:(1)兔ADSCs的培養(yǎng)、鑒定及SDF-1對(duì)ADSCs的增殖、分化作用;(2)雙層PLGA支架制作及SDF-1/PLGA支架對(duì)ADSCs增殖、分化的影響;(3

5、)載有ADSCs的SDF-1/PLGA復(fù)合體修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究。
　　第一部分兔ADSCs的培養(yǎng)、鑒定及SDF-1對(duì)ADSCs的增殖、分化作用
　　目的:觀察SDF-1在2D下對(duì)ADSCs增殖、分化的作用，尋找一種最優(yōu)的SDF-1濃度。
　　方法:取成年新西蘭兔頸部皮下脂肪，用酶消化、梯度離心、貼壁培養(yǎng)法對(duì)兔ADSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)并鑒定。取第三代ADSCs，用含不同濃度的SDF-1(0μg/L、1μg/L、10

6、μg/L、100μg/L、200μg/L)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，RT-PCR方法檢測(cè)ADSCs的CXCR4表達(dá)情況，同時(shí)采用Transwell方法檢測(cè)ADSCs在不同濃度SDF-1作用下的遷移作用。
　　結(jié)果:陽(yáng)性標(biāo)志物CD105，CD73，CD90，CD166，CD29，CD44在ADSCs中均有強(qiáng)陽(yáng)性＞90％的陽(yáng)性表達(dá)，而且ADSCs可以向骨、軟骨、脂肪方向三系分化。SDF-1能促進(jìn)ADSCs增殖、CXCR4

7、的基因表達(dá)及ADSCs的遷移，而且具有濃度依賴性，隨著濃度升高，作用增強(qiáng)。與同等濃度SDF-1組相比，經(jīng)anti-CXCR4處理后ADSCs增殖、CXCR4表達(dá)及遷移均降低，仍高于正常對(duì)照組。
　　結(jié)論:SDF-1可以促進(jìn)ADSCs增殖和遷移，并且隨著濃度升高，其作用增強(qiáng);SDF-1可能通過(guò)上調(diào)CXCR4的表達(dá)并與之結(jié)合在促進(jìn)ADSCs的體外增殖和遷移中起關(guān)鍵作用;SDF-1促進(jìn)ADSCs的增殖和遷移作用中可能存在的信號(hào)分子機(jī)制仍

8、需進(jìn)一步的研究。
　　第二部分雙層PLGA支架制作及SDF-1/PLGA支架對(duì)ADSCs增殖、分化的影響
　　目的:觀察SDF-1從PLGA支架中的釋放效率及在3D環(huán)境下SDF-1對(duì)ADSCs增殖、分化的影響。
　　方法:用明膠顆粒作為致孔劑，利用致孔劑浸出技術(shù)制作雙層PLGA支架。將SDF-1溶液(100ng/ml)30μl加入到PLGA支架上，利用ellisa試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)SDF-1釋放情況，計(jì)算其累積釋放效

9、率;同時(shí)將ADSCs種植于支架上，研究在3D環(huán)境下，緩釋的SDF-1對(duì)ADSCs的增殖及CXCR4基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:我們制作的PLGA支架具有致密層和疏松層，即具有大、小兩層微孔，大孔直徑在400μm和小孔直徑150μm左右。ADSCs在支架大孔壁上鋪展良好，激光共聚焦顯微鏡顯示ADSCs在支架上有很好的活性。SDF-1能從SDF-1/PLGA支架中緩慢釋放，在第一天，大約60％的SDF-1從PLGA支架中釋放，此后維持

10、穩(wěn)定速度釋放，在第30天，仍能檢測(cè)到SDF-1的釋放;而且從PLGA支架緩慢釋放的SDF-1能促進(jìn)ADSCs的CXCR4的表達(dá)，與平面培養(yǎng)相比，在3D環(huán)境下ADSCs的CXCR4的表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論:ADSCs在SDF-1/PLGA支架上能良好的生長(zhǎng);SDF-1能有效的從PLGA支架中釋放，而且同2D環(huán)境下比較，在3D下體外釋放的SDF-1更能促進(jìn)ADSCs的CXCR4表達(dá)，將進(jìn)一步促進(jìn)ADSCs遷移和歸巢，在軟骨缺損的再生

11、修復(fù)中有廣闊的應(yīng)用空間。
　　第三部分載有ADSCs和SDF-1的PLGA復(fù)合體修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究
　　目的:探索ADSCs聯(lián)合具有緩釋作用的SDF-1/PLGA支架能協(xié)調(diào)作用促進(jìn)兔關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，延緩再生軟骨的退變，探討移植的同種異體的ADSCs在體內(nèi)能夠存活。
　　方法:取48只新西蘭大白兔，在股骨髁髕股關(guān)節(jié)部位制作關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。隨機(jī)分為3組，每組16只，分別為PLGA組，ADSCs/PLGA組，SDF-

12、1/ADSCs/PLGA組。各組分別于術(shù)后第6周和第12周收取包含修復(fù)組織的股骨髁，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察。并在12周用RT-qPCR檢測(cè)修復(fù)組織中Aggrecan，Sox9，Collagen typeⅠ，Ⅱ和Ⅹ等基因表達(dá)情況，利用confocal和熒光追蹤的方法評(píng)估移植的ADSCs的存活情況。
　　結(jié)果:和PLGA組、ADSCs/PLGA組相比，SDF-1/ADSCs/PLGA組有最多的再生軟骨和GAG含量，其ICRS評(píng)分和再生

13、組織的彈性模量顯著高于其余兩組(P＜0.05);進(jìn)一步的再生組織的相關(guān)基因的檢測(cè)顯示:SDF-1/ADSCs/PLGA組的軟骨向Aggrecan，SOX9，Collagen typeⅡ基因的量顯著高于其余兩組(P＜0.05)，而collagentypeⅠ、Ⅹ的表達(dá)顯著低于其余兩組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:載有SDF-1的雙層PLGA支架聯(lián)合ADSCs能有效的促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生修復(fù)和界面整合，提高軟骨修復(fù)質(zhì)量，而且移植的同種