來(lái)氟米特對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的作用及機(jī)制研究.pdf

1、葡萄膜炎（uveitis）是臨床上常見(jiàn)的致盲性眼病之一，常導(dǎo)致眼組織的嚴(yán)重破壞以致視功能的顯著下降或喪失。在葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制中，自身免疫反應(yīng)一直被認(rèn)為起著重要的作用。因而，從自身免疫的角度闡明葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療方案是迫切需要的。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis, EAU）作為一種常用的葡萄膜炎動(dòng)物模型,其臨床特點(diǎn)與病理特征與人類葡萄膜炎有許多類似之處。EAU主要影響

2、眼后段，是代表人類一些自身反應(yīng)性葡萄膜炎的常用動(dòng)物模型。EAU主要是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，最近的研究表明Th1和Th17細(xì)胞可能共同參與免疫應(yīng)答過(guò)程，參與了EAU發(fā)病過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞可以在IFN-γ基因缺陷小鼠中誘發(fā)葡萄膜炎，表明Th17細(xì)胞具有單獨(dú)誘導(dǎo)EAU的能力，因而Th17細(xì)胞與EAU的發(fā)生有著密切聯(lián)系。
　　來(lái)氟米特（leflunomide，LEF）是人工合成的異唑衍生物類抗炎及

3、免疫抑制劑，臨床上應(yīng)用于器官移植、關(guān)節(jié)炎和狼瘡性腎炎等疾病，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗增生和免疫抑制的作用?？诜笤隗w內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性代謝物 A771726而發(fā)揮作用， A771726在淋巴細(xì)胞增生活化、免疫應(yīng)答的抗原感應(yīng)識(shí)別等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生抑制作用,具有多種免疫抑制作用,被認(rèn)為是一種極具潛力的免疫抑制劑。有研究報(bào)道來(lái)氟米特與糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用治療慢性非肉芽腫性葡萄膜炎，但來(lái)氟米特直接應(yīng)用于臨床葡萄膜的治療尚不多見(jiàn)。
　　本

4、課題通過(guò)建立大鼠光感受器間維生素 A類結(jié)合蛋白誘導(dǎo)的自身免疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)口服來(lái)氟米特對(duì)EAU的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)改變的作用，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、RT-PCR、Western免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)炎癥細(xì)胞相關(guān)因子 IL-17、IFN-γ的表達(dá)及其意義。A771726是來(lái)氟米特的活性代謝產(chǎn)物，EAU模型體外培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)EAU大鼠CD4+T細(xì)胞向Th17分化，并加入不同濃度A771726干

5、預(yù)，流式細(xì)胞儀與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)Th17細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子的水平，RT-PCR檢測(cè)Th17相關(guān)基因表達(dá)變化，分析A771726對(duì)EAU大鼠體外誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。為研究葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的理論依據(jù)。
　　本課題的研究主要分為以下兩個(gè)部分
　　1．探討來(lái)氟米特體內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的保護(hù)作用
　　采用光感受器間維生素 A類結(jié)合蛋白（IRBP）與完全弗氏佐劑充分乳化后于Lewis

6、大鼠左足底皮下注射，同時(shí)經(jīng)腹腔注射百日咳毒素(Pertussistoxin，PTX)400ng增強(qiáng)免疫。以建立EAU模型，隨機(jī)分為正常組、模型組、來(lái)氟米特給藥組（3mg/kg;6mg/kg;12mg/kg）、環(huán)孢霉素陽(yáng)性對(duì)照組（10 mg/kg），每組6-8只。于造模第二天開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，灌胃13天。裂隙燈顯微鏡觀察大鼠EAU的癥狀，造模后第14天制備大鼠眼球切片，以蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，參照Caspi的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)E

7、AU各組大鼠進(jìn)行臨床癥狀和病理學(xué)分級(jí)進(jìn)行評(píng)分，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)IL-17多克隆抗體在各組大鼠眼組織中的表達(dá)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中IL-17、IFN-γ和IL-6含量，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠血和脾臟 CD4+Th17細(xì)胞亞群純度，使用 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠眼組織IL-17mRNA、IFN-γmRNA、STAT3mRNA表達(dá)水平，Western Blot技術(shù)檢測(cè)EAU大鼠眼組織中p-STAT3的相對(duì)含量

8、。造模后8-9天模型組大鼠EAU開(kāi)始出現(xiàn)炎癥，在第14天時(shí)炎癥達(dá)到高峰期，隨后炎癥迅速消退。Lewis大鼠成功誘發(fā)出EAU疾病模型，患病率高達(dá)100％，且臨床表現(xiàn)及組織學(xué)特征穩(wěn)定。在來(lái)氟米特給藥組的大鼠中，14天時(shí)EAU發(fā)病的臨床評(píng)分均低于模型組，病理學(xué)檢查顯示各給藥組大鼠眼組織病變程度明顯較模型組減輕。免疫組化顯示模型組虹膜、睫狀體和視網(wǎng)膜部位可見(jiàn)IL-17蛋白表達(dá)，來(lái)氟米特各劑量組眼部IL-17蛋白表達(dá)明顯減少。來(lái)氟米特用藥組中大鼠

9、血清中IL-17、IFN-γ和IL-6含量均明顯低于模型組。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠血和脾臟Th17細(xì)胞亞群比例顯著升高，而給予來(lái)氟米特后可顯著抑制EAU大鼠血和脾臟Th17細(xì)胞亞群的分化增殖，且呈劑量依賴性，各組間差異有顯著性。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)氟米特可明顯降低EAU大鼠眼組織中IL-17mRNA、IFN-γmRNA、STAT3mRNA表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果顯示，EAU大鼠發(fā)病高峰時(shí)，眼組織p

10、-STAT3表達(dá)增加，而來(lái)氟米特用藥組抑制p-STAT3表達(dá)。在EAU發(fā)展中，IL-17作為Th17細(xì)胞分泌的特異性因子，參與EAU的發(fā)病過(guò)程并起到重要作用。EAU發(fā)病過(guò)程中存在STAT3通路的激活?？诜?lái)氟米特能有效抑制EAU大鼠的眼部病情，抑制EAU眼組織中IL-17、IFN-γ等炎性因子和p-STAT3表達(dá)，抑制大鼠血清中炎性因子的表達(dá)而對(duì)EAU起保護(hù)作用。
　　2. A771726在體外對(duì)EAU大鼠Th17細(xì)胞分化增殖的影

11、響及其機(jī)制探討
　　制作EAU模型，提取大鼠致敏14d的脾細(xì)胞CD4+T細(xì)胞，置于含有IRBP抗原的細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和白細(xì)胞介素（IL-6、IL-23）等細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)，促使其向Th17細(xì)胞方向分化，將體外培養(yǎng)的Th17細(xì)胞分為6組，分別用不同劑量的A771726（0.1、1、10μM）和STAT3特異性抑制劑S31-201，培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞與上清液，通過(guò)流式細(xì)胞儀與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)Th1

12、7細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子的水平，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)各組IL-17mRNA、ROR-rtmRNA、STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量，Western-blot檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（P-STAT3）蛋白的表達(dá)。A771726可抑制EAU大鼠Th17細(xì)胞分化增殖，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中用藥組IL-17的濃度降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各用藥組中Th17細(xì)胞的分化增殖明顯減少，各組 IL-17mRNA、ROR-rtmRNA

13、、STAT3mRNA的表達(dá)量降低，P-STAT3蛋白的表達(dá)下降，且呈劑量依賴性。研究發(fā)現(xiàn)在EAU大鼠抗原特異性Th17細(xì)胞的分化后，TGF-β單獨(dú)或聯(lián)合IL-6刺激不能促進(jìn)Th17細(xì)胞進(jìn)一步分化，TGF-β、IL-6和IL-23可誘導(dǎo)或促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。大鼠EAU發(fā)病過(guò)程中存在STAT3通路的激活，STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)了EAU大鼠Th17細(xì)胞的分化、增殖。A771726抑制抗原特異性Th17細(xì)胞分化增殖，其機(jī)制可能與抑制IL-1