一類新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)以及產(chǎn)生和功能的初探.pdf

1、非編碼RNA通過(guò)不同的路徑來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，它與許多生理活動(dòng)和疾病有關(guān)。而環(huán)RNA作為非編碼RNA的一種，30多年前就被發(fā)現(xiàn)了，但是人們當(dāng)時(shí)只是把它當(dāng)作一類轉(zhuǎn)錄本在發(fā)生錯(cuò)誤剪接和拼接過(guò)程中形式的垃圾RNA分子。直到2013年人們才認(rèn)識(shí)到環(huán)狀RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是普遍存在的，其中有一類環(huán)RNA序列當(dāng)中充滿了小RNA的結(jié)合位點(diǎn)，可起到“海綿”的作用，能夠在每個(gè)環(huán)RNA分子上結(jié)合大量的小RNA。已有的研究表明環(huán)狀RNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演著一個(gè)

2、重要角色，環(huán)RNA已成為目前分子生物學(xué)領(lǐng)域的國(guó)際熱點(diǎn)課題之一。本文正是在已有的關(guān)于環(huán)RNA研究的基礎(chǔ)上，從實(shí)驗(yàn)上對(duì)環(huán)RNA進(jìn)行了深入和細(xì)致的研究，取得了以下重要的成果:
　　(1)在研究與調(diào)控polⅡ轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)一類新的環(huán)RNA。選取其中15個(gè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這類環(huán)RNA是不同于之前研究人員發(fā)現(xiàn)的。它是由外顯子-內(nèi)含子-外顯子構(gòu)成的，而連接部分必須是由兩個(gè)外顯子連接在一起的，中間是由內(nèi)含子構(gòu)成的。這類環(huán)RNA在不同

3、細(xì)胞中表現(xiàn)出組織特異性。例如，CLTCmRNA在兩種細(xì)胞中都有表達(dá)，但是circCLTC只在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，而在HEK293細(xì)胞中是不表達(dá)。同時(shí)，我們檢測(cè)了其中兩個(gè)CircEIF3J和CircPAIP2在HeLa細(xì)胞中的拷貝數(shù)，分別大約為31個(gè)和22個(gè)。
　　(2)對(duì)比這15個(gè)circular RNA的前后序列，發(fā)現(xiàn)其中有4個(gè)是有前后互補(bǔ)的Alu序列，還有4個(gè)雖然不是Alu序列，但是前后也有堿基互補(bǔ)的序列。通過(guò)構(gòu)建circEI

4、F3J和circPAIP2的四種不同目的片段的環(huán)RNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后來(lái)檢測(cè)這兩個(gè)環(huán)RNA在細(xì)胞和細(xì)胞核中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)如果環(huán)RNA前后的互補(bǔ)序列越多，產(chǎn)生的circular RNA也越多，可能是這樣很容易構(gòu)成一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，便于環(huán)RNA的剪切。但是我們卻發(fā)現(xiàn)這些人工構(gòu)建的circular RNA不會(huì)對(duì)它們parent基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。
　　(3) Alu元件作為為哺乳類動(dòng)物所特有的的短散在元件，可能在對(duì)環(huán)RNA的產(chǎn)生過(guò)程當(dāng)中起到非常

5、重要的作用。所以，構(gòu)建了一類全新環(huán)RNA質(zhì)粒，在人類細(xì)胞中是不可能自然產(chǎn)生的。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)這四個(gè)質(zhì)粒也能夠產(chǎn)生環(huán)RNA的，但是跑膠的目的條帶卻是彌散的，推測(cè)是產(chǎn)生環(huán)RNA時(shí)剪切位點(diǎn)不同。
　　(4)通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)這類環(huán)RNA的銜接位點(diǎn)兩端處都有AG-GT序列，這個(gè)序列是否對(duì)環(huán)RNA的產(chǎn)生或功能有影響了？構(gòu)建了兩批不同的質(zhì)粒，一類是以GFP為報(bào)告基因的，一類是熒光素酶為報(bào)告基因的。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AG-GT序列對(duì)環(huán)RNA的產(chǎn)生沒(méi)有影