防風(fēng)提取物聯(lián)合三氧化二砷對(duì)急、慢性髓系白血病體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:以人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60和人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討ATO及防風(fēng)提取物對(duì)該細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響。檢測(cè)防風(fēng)提取物單獨(dú)與聯(lián)合ATO后對(duì)HL-60、K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其分子機(jī)制。建立NOD/SCID-AML小鼠模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證防風(fēng)提取物對(duì)ATO的減毒增效作用。
　　方法:
　　1.防風(fēng)提取物抑制HL-60、K562細(xì)胞增殖的作用研究
　　不同劑量防風(fēng)提取物(1500、1

2、250、1000、750、500、250μg/ml)作用于HL-60和K562細(xì)胞株48h。MTT法檢測(cè)防風(fēng)提取物對(duì)HL-60、K562細(xì)胞增殖的影響并計(jì)算出防風(fēng)提取物對(duì)HL-60、K562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　2.防風(fēng)提取物聯(lián)合ATO對(duì)HL-60、K562增殖、凋亡的影響
　　采用HL-60和K562兩種細(xì)胞株，分為空白對(duì)照組、防風(fēng)提取物組、ATO組、防風(fēng)提取物聯(lián)合ATO組。MTT法檢測(cè)H

3、L-60、K562細(xì)胞增殖變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL-60、K562細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。
　　3.建立NOD/SCID-AML小鼠模型
　　NOD/SCID小鼠，雄性，3～4周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F、G7組。A、B、C組小鼠接種腫瘤細(xì)胞前給予300 cGy60Co照射（照射劑量率為116 cGy/min），照射后24h內(nèi)尾靜脈注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞(A組:1×107/只;B組:5×106

4、/只;C組:3×106/只)。D、E、F組小鼠無預(yù)處理，直接尾靜脈注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞（D組:1×107/只;E組:5×106/只;F組:3×106/只）。G組小鼠不做處理為正常對(duì)照組。日常觀察小鼠的發(fā)病和身體淺表部位腫瘤生長(zhǎng)情況;通過流式細(xì)胞儀分析外周血、肝脾組織和骨髓中HL-60細(xì)胞比例;取瀕死小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、骨髓及腫瘤組織，進(jìn)行組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查，綜合判斷模型是否建立成功。
　　4.基于NOD/SC

5、ID-AML小鼠模型，觀察防風(fēng)提取物減毒增效功能的實(shí)驗(yàn)研究
　　建模:4～5周齡NOD/SCID小鼠尾靜脈注射1×107的HL-60細(xì)胞，定期檢查小鼠外周血細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血中CD33陽(yáng)性率，確定模型建立成功。分組:建模后的小鼠隨機(jī)分為4組:模型組（不給予藥物治療）、單用防風(fēng)提取物組（500 mg/kg灌胃×15d）、單用ATO組(3 mg/kg ATO腹腔注射×15d)、防風(fēng)提取物聯(lián)合ATO組（500 mg/kg

6、防風(fēng)提取物灌胃+3 mg/kg ATO腹腔注射×15d），觀察各組小鼠生存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)后期，每組隨機(jī)麻醉處死3只小鼠，采集主要臟器標(biāo)本，觀察臟器損傷情況。
　　結(jié)果:
　　1.防風(fēng)提取物能夠抑制K562、HL-60細(xì)胞增殖
　　750、1000、1250、1500μg/ml防風(fēng)提取物對(duì)K562細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，48h的OD值與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）;防風(fēng)提取物6個(gè)濃度組對(duì)HL-60細(xì)胞有明顯增殖抑

7、制作用，48h的OD值與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），其抑制增殖的作用呈劑量依賴性。
　　2.防風(fēng)提取物能夠增強(qiáng)ATO對(duì)K562、HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用
　　防風(fēng)提取物與ATO具有協(xié)同抑制HL-60、K562細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，這種協(xié)同抑制作用隨著防風(fēng)提取物濃度的增加而增強(qiáng);500、250μg/ml防風(fēng)提取物分別與1μg/ml、2μg/ml ATO聯(lián)用對(duì)K562細(xì)胞的凋亡率與空白對(duì)照組或ATO組相比顯著升高(P＜

8、0.05);500、250μg/ml防風(fēng)提取物分別與1、0.5μg/ml ATO聯(lián)用對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡率與空白對(duì)照組或ATO組相比顯著升高（P＜0.05）;2、1、0.5μg/ml ATO作用48h后，與空白對(duì)照組相比，K562細(xì)胞G2-M期比例升高、G0-G1期細(xì)胞比例降低;HL-60細(xì)胞G0-G1期、G2-M期細(xì)胞比例升高、S期細(xì)胞比例降低。兩藥聯(lián)用后K562細(xì)胞S期細(xì)胞比例與空白對(duì)照組或單用ATO組升高;HL-60細(xì)胞周期的變

9、化不規(guī)律，凋亡細(xì)胞比例與空白對(duì)照組或ATO組相比顯著升高(P＜0.05)并呈現(xiàn)出劑量依賴性。
　　3.NOD/SCID-AML小鼠模型建立成功
　　造模10d左右，小鼠外周血涂片中可檢測(cè)到HL-60細(xì)胞;28d左右，部分小鼠出現(xiàn)后肢癱瘓的癥狀;35d左右，部分小鼠身體淺表部位出現(xiàn)實(shí)體瘤，各處理組小鼠全部發(fā)病，發(fā)病后期外周血、骨髓可檢測(cè)到大量白血病細(xì)胞并浸潤(rùn)到肝、脾等臟器。40d左右，小鼠陸續(xù)死亡，60Co照射過的所有小鼠在5

10、2d內(nèi)死亡，平均生存時(shí)間為(39.33±12.66)d;沒有接受60Co照射的所有小鼠在64d內(nèi)全部死亡，平均生存時(shí)間為(55.67±10.41)d，發(fā)病率為100％，證實(shí)NOD/SCID-AML小鼠模型建立成功。
　　4.防風(fēng)提取物聯(lián)合ATO能夠延長(zhǎng)NOD/SCID-AML模型小鼠的生存時(shí)間
　　聯(lián)合用藥組小鼠生存時(shí)間與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05），防風(fēng)提取物組和ATO組無顯著性差異。各治療組小鼠生命延長(zhǎng)率分別為

11、:單用ATO組36％，單用防風(fēng)組37.3％，聯(lián)合用藥組51.8％。主要臟器病理切片顯示，與模型組相比，治療組臟器病變有不同程度減輕，腎臟較明顯。
　　結(jié)論:
　　1.防風(fēng)提取物具有一定程度的抑制K562、HL-60細(xì)胞增殖的能力，其抑制作用呈濃度依賴性。
　　2.防風(fēng)提取物能夠增強(qiáng)ATO對(duì)K562、HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用。增強(qiáng)ATO對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用可能與協(xié)同ATO誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡和S期細(xì)胞周期阻滯

12、有關(guān)。增強(qiáng)ATO對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用可能與協(xié)同ATO誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　3.4～5周齡NOD/SCID小鼠尾靜脈注射3×106～1×107個(gè)HL-60細(xì)胞，無論是否接受60Co照射均能表現(xiàn)出全身白血病癥狀。這種方法建立的白血病小鼠模型是國(guó)內(nèi)外評(píng)價(jià)藥物對(duì)白血病增殖、分化等作用機(jī)制研究的常用模型。
　　4.防風(fēng)提取物具有增強(qiáng)ATO對(duì)NOD/SCID-AML小鼠模型的治療作用，并能改善小鼠臟器受損情況，該實(shí)