中國櫻桃PpcERF基因克隆與功能研究.pdf

1、ERF類轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP超家族重要成員之一，在植物體內(nèi)起著激活或抑制基因表達(dá)的功能。該類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列中含有一個高度保守的60個左右氨基酸組成的AP2結(jié)合域。ERF類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育，且常作用于調(diào)節(jié)多種功能基因的表達(dá)，參與植物抗逆脅迫應(yīng)答，進(jìn)而提高植物抗逆能力。
　　本研究從中國櫻桃(Prunus pseudocerasus)轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得了一個ERF類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，命名為PpcERF，克隆分析P

2、pcERF基因的序列結(jié)構(gòu)，利用實時熒光定量PCR技術(shù)及遺傳轉(zhuǎn)化手段分析PpcERF基因的表達(dá)和功能特性，并取得以下主要研究結(jié)果:
　　1.克隆獲得的PpcERF基因開放閱讀框長度為1059 bp，編碼352個氨基酸殘基，分子量約為39 kD。含有單一、保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。疏水性/親水性分析表明PpcERF為親水性蛋白。PpcERF氨基酸序列與李屬植物氨基酸序列的相似度較高。聚類分析發(fā)現(xiàn)該基因與碧桃ERF基因具有較近親緣關(guān)系

3、。在擬南芥基因數(shù)據(jù)庫中比對后發(fā)現(xiàn)與ERF5/6相似性較高，推測PpcERF基因與擬南芥ERF5/6基因具有相似功能。
　　2.為了能夠利用Real-time PCR技術(shù)準(zhǔn)確分析PpcERF基因的表達(dá)模式，本研究直先對18S rRNA、ACTB、TUB、UBCE、TIF5A、EF1B和GAPDH7個看家基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。通過實時熒光定量PCR擴(kuò)增，利用Genorm、Bestkeeper、NormFinder、△Ct以及在線評估

4、程序確定了4℃和NaCl處理下較可靠的內(nèi)參基因是GAPDH，在ABA處理下和花芽休眠解除過程中較合適的內(nèi)參基因分別是ACTB和UBCE。
　　3.利用Real-time PCR技術(shù)對PpcERF基因在不同處理條件下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在H2O2和PEG2000處理下，PpcERF基因的表達(dá)量呈先上升后下降趨勢;在4℃處理抑制PpcERF基因表達(dá);在低溫誘導(dǎo)櫻桃花芽休眠解除過程中，低溫積累達(dá)到236 C.U時，表達(dá)量達(dá)到最

5、高，隨后下降;在ABA和NaCl處理下，PpcERF基因的表達(dá)量變化不明顯。因此認(rèn)為PpcERF基因可能參與氧化脅迫、干旱脅迫以及低溫脅迫響應(yīng)。
　　4.為更加深入研究PpcERF基因的功能，本研究構(gòu)建了植物表達(dá)載體，由35S啟動子驅(qū)動該基因表達(dá)。利用蘸花法獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。超量表達(dá)PpcERF基因擬南芥植株整體偏小，葉片卷曲其較薄。使用不同濃度H2O2對擬南芥種子進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在含有4mmol/LH2O2培