土煙葉,洋蔥精、卵細胞的分離.pdf

1、被子植物具有獨特的雙受精現(xiàn)象，姊妹精細胞中的一個與卵細胞結(jié)合發(fā)育成胚，另一個與中央細胞結(jié)合發(fā)育成胚乳。受精過程中，精細胞通過花粉萌發(fā)的花粉管進入胚囊，繼而完成雙受精。整個受精過程都是在由體細胞形成的花柱、子房和胚珠內(nèi)完成。因而對于研究受精機理問題形成了障礙。將高等植物的精、卵細胞和其他胚囊細胞分離出來，運用離體誘導(dǎo)精、卵細胞融合并且對人工合子進行離體培養(yǎng)再生植株的離體受精技術(shù)，將克服體細胞組織對受精過程研究的障礙，從而進行細胞和分子水平

2、的研究，達到揭示被子植物受精機理的目的。本實驗中我們嘗試分離土煙葉和洋蔥具有生活力的精細胞和卵細胞，為進一步研究土煙葉和洋蔥雌、雄配子體的分子生物學(xué)特性及受精機理等提供了條件。
　　 土煙葉精細胞分離:土煙葉花粉為二胞型，精細胞在花粉管中形成。通過直接爆破法、離體培養(yǎng)花粉法分離出了土煙葉生殖細胞。然而在離體培養(yǎng)的花粉管中，土煙葉生殖細胞并不分裂形成精細胞。采用半離體培養(yǎng)法（先將花粉在柱頭上授粉并在體內(nèi)生長一段時間后切下花柱進行離

3、體培養(yǎng)，從花柱中誘導(dǎo)出花粉管）成功地分離了精細胞。
　　 土煙葉卵細胞的分離:將土煙葉胚珠先在酶液中酶解10min，然后轉(zhuǎn)移到不含酶液的分離液中，用解剖針從其合點端橫切胚珠，輕輕擠壓珠孔端即可使卵器細胞和中央細胞從切口處逸出。用這種酶解-解剖方法分離了土煙葉胚囊中的卵細胞、助細胞和中央細胞。通常一小時可分離8-12個卵細胞。分離的卵細胞用顯微操作儀收集。土煙葉精、卵細胞的成功分離可在分子水平上研究其精、卵細胞的發(fā)育過程并為開展雙

4、子葉植物離體受精實驗創(chuàng)造了條件。
　　 洋蔥精細胞分離:洋蔥的精細胞屬于二胞花粉，直接爆破法可以收集到大量的活性生殖細胞。采用完全離體培養(yǎng)花粉的方法，將洋蔥成熟花柱放置在培養(yǎng)液中，會促使柱頭附近的少許花粉粒萌發(fā)形成花粉管，但花粉管在各種滲透壓梯度下幾乎均不發(fā)生爆破。采用半離體培養(yǎng)的方法，將體內(nèi)生長23小時授粉花柱切下，體外培養(yǎng)24小時，可從花柱切口部位誘導(dǎo)出花粉管，爆破花粉管可以獲得成對的精細胞。
　　 洋蔥卵細胞分離:

5、將洋蔥的胚珠置于酶液中酶解50～110min后剝?nèi)テ渲楸?，可清楚地看到珠心中的胚囊輪廓。用解剖針將珠心從中部橫切，然后擠壓其珠孔部位，卵器細胞從胚珠的切口處逸出。再用顯微操作儀的玻璃針將卵細胞和兩個助細胞分開，達到分離洋蔥卵細胞的目的。酶對分離卵細胞具有重要作用，在最佳的酶液（0.02％果膠酶Y23，0.08％果膠酶，0.05％纖維素酶和0.05％半纖維素酶）中酶解胚珠110分鐘后，解剖1h可從24個胚珠中分離出10個卵細胞(41.67