小鼠白介素1受體拮抗劑重組蛋白的制備及其預(yù)防化療骨髓毒副作用的研究.pdf

1、本論文的研究目的,是探討白介素1受體拮抗劑(interleukin1receptorantagonist,IL-1Ra)在小鼠骨髓造血系統(tǒng)中的作用及機(jī)制,并且對其進(jìn)行了預(yù)防化療導(dǎo)致的骨髓抑制的臨床前研究。實(shí)驗(yàn)中采用的化療小鼠模型是通過尾靜脈一次性注射5-氟尿嘧啶(5-Fu),導(dǎo)致骨髓損傷和隨后的再生修復(fù)。5-Fu注射后小鼠的骨髓變化分為兩個(gè)階段:首先是第1～7天的骨髓損傷階段;接下來是第8～14天的骨髓再生修復(fù)階段。為了研究細(xì)胞因子對這

2、一損傷―修復(fù)過程的調(diào)控,我們抽提了5-Fu注射后0、3、7、11、14天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠骨髓細(xì)胞RNA,制備了基因芯片。通過基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),在化療后骨髓損傷和修復(fù)過程中許多調(diào)節(jié)因子在基因水平會(huì)呈現(xiàn)不同趨勢的波動(dòng)。其中IL-1Ra的表達(dá)呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。為了驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果,我們對5-Fu注射后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清中的IL-1Ra水平進(jìn)行了ELISA檢測,得到了與芯片相一致的表達(dá)趨勢。這種表達(dá)量劇烈的波動(dòng)使我們認(rèn)為IL-1

3、Ra可能作為一個(gè)內(nèi)源性的造血調(diào)控因子參與了骨髓損傷的修復(fù)過程。為了進(jìn)行體內(nèi)的功能研究,我們首先利用原核表達(dá)pET系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)了重組小鼠的IL-1Ra蛋白,并且利用陰離子交換層析的方法進(jìn)行純化,得到了純度為96％以上的純化產(chǎn)物,經(jīng)內(nèi)毒素檢測合格;并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明該蛋白具有良好的生物學(xué)活性,可以用于下一步的體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)。本論文中通過IL-1Ra在正常小鼠的在體表達(dá)和重組蛋白注射兩個(gè)方法研究了IL-1Ra對小鼠骨髓造血系統(tǒng)的作用。對于在體

4、表達(dá)IL-1Ra的實(shí)驗(yàn),我們構(gòu)建了真核表達(dá)的重組質(zhì)粒pcDNA-IL-1Ra,使用電穿孔的方式,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠的脛前肌。用ELISA的方法檢測轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1Ra在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平。證明在轉(zhuǎn)染后的第5天小鼠血清中的IL-1Ra水平最高,隨后逐漸下降。較高水平的表達(dá)可以維持10天左右。轉(zhuǎn)染后進(jìn)行pcDNA-IL-1Ra質(zhì)粒組和pcDNA3.1質(zhì)粒對照組小鼠的外周血和骨髓細(xì)胞數(shù)的比較。發(fā)現(xiàn)在第5天IL-1Ra可以降低骨髓細(xì)胞總數(shù)

5、,并且在第10天和第17天pcDNA-IL-1Ra質(zhì)粒組的外周血白細(xì)胞和血小板數(shù)均低于pcDNA3.1質(zhì)粒對照組。通過該實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為,IL-1Ra可以影響小鼠骨髓的造血平衡。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為基因治療的一種,雖然能夠有效的導(dǎo)入外源基因,但是對機(jī)體的損傷較大,并且表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量都難以控制。因此我們采用有活性的重組小鼠IL-1Ra蛋白(rMuIL-1Ra)皮下注射的給藥方式進(jìn)行該基因在小鼠骨髓造血系統(tǒng)中的功能研究。在正常小鼠中的量效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

6、,連續(xù)注射rMuIL-1Ra(1mg/kg)5天后,除單核細(xì)胞外,IL-1Ra顯著降低小鼠骨髓細(xì)胞(BMcells)、外周血白細(xì)胞(WBC)、粒細(xì)胞(GR)、淋巴細(xì)胞(LY)的數(shù)量,且減少的細(xì)胞數(shù)量在5到10天恢復(fù)到rMuIL-1Ra注射前水平。結(jié)果證明IL-1Ra對正常小鼠造血功能具有可逆性抑制作用。我們選取1mg/kg體重的劑量在正常小鼠中進(jìn)行rMuIL-1Ra蛋白分別連續(xù)注射1天、3天、5天、7天、9天的時(shí)效實(shí)驗(yàn)。連續(xù)注射rMuI

7、L-1Ra蛋白1天、3天、5天的實(shí)驗(yàn)組的骨髓細(xì)胞數(shù)逐漸下降,而繼續(xù)注射rMuIL-1Ra7天至9天骨髓細(xì)胞數(shù)雖然仍低于對照組,但是比連續(xù)注射5天組有所上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白5天對正常小鼠骨髓細(xì)胞數(shù)的抑制最大。通過對該實(shí)驗(yàn)中幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠外周血血清中IL-1β水平的ELISA檢測,發(fā)現(xiàn)外源rMuIL-1Ra蛋白的注射可以影響小鼠體內(nèi)IL-1β水平的變化。連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白5天時(shí),小鼠體內(nèi)的IL-1β

8、水平顯著上升，持續(xù)注射該蛋白5天以上小鼠體內(nèi)IL-1β水平會(huì)回落至正常范圍。接下來進(jìn)一步研究rMuIL-1Ra對5-Fu化療小鼠造血系統(tǒng)的作用。我們進(jìn)行了五個(gè)部分的實(shí)驗(yàn):(1)5-Fu前2天或者5天預(yù)防性應(yīng)用rMuIL-1Ra對化療小鼠骨髓損傷的保護(hù)作用;(2)5-Fu后5天治療性應(yīng)用rMuIL-1Ra對化療小鼠骨髓損傷的緩解作用;(3)5-Fu前后各2天連續(xù)注射rMuIL-1Ra對小鼠血象的觀察比較;(4)5-Fu后第7～10天連續(xù)注

9、射rMuIL-1Ra對小鼠血象的觀察比較;(5)注射rMuIL-1Ra對5-Fu反復(fù)化療小鼠的骨髓保護(hù)作用。所有實(shí)驗(yàn)組都設(shè)一個(gè)相應(yīng)的無熱源PBS對照組,并且rMuIL-1Ra蛋白都是每天一次皮下注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5-Fu化療前的預(yù)防性應(yīng)用和5-Fu化療后的治療性應(yīng)用rMuIL-1Ra蛋白均對化療產(chǎn)生的骨髓損傷起到緩解作用。前四組實(shí)驗(yàn)相對于對照組比較均在不同程度上促進(jìn)了外周血血小板和骨髓細(xì)胞的恢復(fù);5-Fu(280mg/kg)前2天連續(xù)

10、注射rMuIL-1Ra可以使小鼠的存活率從70%提高到95%;亞致死劑量5-Fu(300mg/kg)前5天連續(xù)注射rMuIL-1Ra可以使小鼠的存活率從30%提高到75%;亞致死劑量300mg/kg的5-Fu后5天連續(xù)注射rMuIL-1Ra使小鼠存活率從20%提高到90%;5-Fu后第7～10天連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白在第11天的外周血血小板的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的低于PBS對照組。rMuIL-1Ra對5-Fu反復(fù)化療的小鼠造血系統(tǒng)仍

11、然能夠起到保護(hù)作用,體現(xiàn)在對外周血淋巴細(xì)胞,血小板恢復(fù)的促進(jìn)和小鼠體重的恢復(fù)上。關(guān)于IL-1Ra可以保護(hù)化療造成的骨髓損傷的機(jī)制研究,我們首先取正常小鼠連續(xù)5天皮下給藥rMuIL-1Ra后24h內(nèi)處死小鼠,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測骨髓中不同造血細(xì)胞亞群細(xì)胞周期數(shù)據(jù)。骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNC)被逐級分為:未成熟細(xì)胞(Lin-,細(xì)胞不表達(dá)成熟血細(xì)胞表面標(biāo)志);造血祖細(xì)胞(KL細(xì)胞,Lin--c-kit);造血干細(xì)胞(SKL細(xì)胞,Sca-1+-c-k

12、it+-Lin-)。結(jié)果顯示,處于S和G2/M期的4類細(xì)胞亞群均顯著減少;處于G1期的KL和SKL細(xì)胞均顯著減少,而G0期細(xì)胞相應(yīng)顯著增多。我們的結(jié)論是:IL-1Ra作用的靶細(xì)胞是骨髓造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞;rMuIL-1Ra注射小鼠后,驅(qū)使小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞靜止期G0期,表現(xiàn)為G0期細(xì)胞增多,G1、S和G2/M期細(xì)胞減少。也就是說IL-1Ra的注射減緩了細(xì)胞周期的循環(huán)和細(xì)胞的增殖。這從機(jī)理上解釋了預(yù)防性應(yīng)用rMuIL-1R

13、a于細(xì)胞周期特異性的化療藥物5-Fu之前,能夠減少骨髓細(xì)胞進(jìn)入S期的數(shù)量從而對小鼠骨髓起到保護(hù)作用,緩解化療對骨髓的損傷。其次,我們獲取5-Fu化療前預(yù)防性應(yīng)用rMuIL-1Ra的小鼠骨髓,檢測其對造血祖細(xì)胞集落形成的影響。結(jié)果顯示,和對照組相比,正常小鼠連續(xù)5天注射MuIL-1Ra重組蛋白可以顯著的減少小鼠每條腿的骨髓造血祖細(xì)胞的集落數(shù)量。而化療之后的第3天和第7天,蛋白組造血祖細(xì)胞集落的數(shù)量都顯著高于對照組。體內(nèi)IL-1Ra的含量和

14、IL-1β的水平是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程,如果IL-1在體內(nèi)含量過高,機(jī)體會(huì)分泌更多IL-1Ra來拮抗IL-1,以恢復(fù)二者的平衡狀態(tài)。因此,我們運(yùn)用ELISA的手段對化療小鼠不同時(shí)間連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠體內(nèi)的IL-1β的水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,在5-Fu后連續(xù)注射5天的實(shí)驗(yàn)組中,小鼠外周血中的IL-1β的水平的升高相對于對照組和其它兩種給藥組明顯提前。其它幾組都是在第11天IL-1β的水平達(dá)到最高,而5-Fu后連

15、續(xù)注射5天的實(shí)驗(yàn)組的IL-1β的水平在第7天達(dá)到最高。這更確切地說明外源的rMuIL-1Ra蛋白的連續(xù)注射可以引起小鼠體內(nèi)IL-1β水平的升高。這也解釋了在5-Fu后治療性應(yīng)用rMuIL-1Ra蛋白可以對小鼠的血小板和骨髓的恢復(fù)起到促進(jìn)作用。并且IL-1β水平的升高更可能是促進(jìn)血小板恢復(fù)的重要原因。綜合以上的研究結(jié)果,我們可以得出結(jié)論:應(yīng)用rMuIL-1Ra蛋白可以促進(jìn)化療引起的小鼠骨髓損傷的恢復(fù);在5-Fu化療之前的預(yù)防性應(yīng)用和之后的