蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)非酒精性單純性脂肪肝小鼠模型建立與益生菌治療的動(dòng)態(tài)觀察.pdf

1、[研究目的]:非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)在我國(guó)是高患病率的慢性肝臟疾病，發(fā)病率逐年上升。NAFLD的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為是一種與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷。NAFLD疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性

2、肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)以及肝硬化，并最終可進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。因此，盡早的對(duì)NAFLD進(jìn)行干預(yù)是改善患者預(yù)后的重要手段，而目前尚無(wú)有充足循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的藥物治療手段。并且，因其作為金標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)診斷存在創(chuàng)傷，該疾病的目前診斷主要依賴臨床診斷，診斷的準(zhǔn)確性和敏感性仍有待提高，尤其非酒精性單純性脂肪肝因其發(fā)病隱匿、癥狀不典型，因而發(fā)現(xiàn)較為困難。因此，建立合適的動(dòng)物模型模型對(duì)于研究非酒精性單純性脂

3、肪肝疾病的規(guī)律、改善診斷和治療手段的意義重大。
　　 [研究方法]:研究分為兩個(gè)部分。第一部分:1、根據(jù)隨機(jī)分組的原則，24只小鼠隨機(jī)分入觀察組(n=12)和正常對(duì)照組(n=12);2、觀察組小鼠給予蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(MCDD)飼養(yǎng)3周，對(duì)照組給予正常飲食;3、動(dòng)態(tài)觀察小鼠的一般情況，定期稱取體重、留取新鮮糞便標(biāo)本進(jìn)行四種細(xì)菌屬的培養(yǎng)（包括大腸桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌）;4、分別于第8、15、22d處死小鼠，處死后

4、采集血清標(biāo)本和肝臟標(biāo)本;5、鹿清標(biāo)本用于檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甘油三酯(TG)，并采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)腫瘤壞死因子a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)以及脂多糖(LPS)水平。第二部分:1、對(duì)32只上述2周模型小鼠再次進(jìn)行隨機(jī)分組，分為藥物治療組(D組，n=16)和飲食恢復(fù)組(B組，n=16)，并按1∶2設(shè)立正常對(duì)照同周齡小鼠8只（C組，n=8）;2、對(duì)藥物治療組小鼠每日兩次經(jīng)胃管給予培菲康治

5、療，時(shí)間共計(jì)6周;3、動(dòng)態(tài)觀察小鼠的一般情況，定期稱重、進(jìn)行糞便細(xì)菌培養(yǎng);4、于第43天處死小鼠，處死后采集血清標(biāo)本和肝臟標(biāo)本;5、所得肝臟標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)診斷并進(jìn)行評(píng)分量化;6、對(duì)所采集血清標(biāo)本進(jìn)行ALT、AST、TG、TNF-a、IL-6、LPS檢測(cè);7、上述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，干預(yù)治療效果比較采用單因素方差分析，均以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義。
　　 [結(jié)果]:
　　 第一部分:
　　 1、經(jīng)MCD飲食誘導(dǎo)，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)紊亂等現(xiàn)象，病理分析明確從第8d起小鼠肝臟內(nèi)即出現(xiàn)肝脂肪性變，而8d、15d時(shí)間節(jié)點(diǎn)小鼠的肝臟病理NAS評(píng)分均在3-4分間，與22d（＞5分）、正常對(duì)照組（0分）有差異，提示MCD誘導(dǎo)2周即可出現(xiàn)穩(wěn)定NAFL小鼠模型，并且病變階段控制在NAFL階段。
　　 2、MCDD模型小鼠與對(duì)照組小鼠相比體重從第4天起下降明顯

7、(P=0.02)，并出現(xiàn)毛發(fā)紊亂、精神萎靡等一般情況的改變;糞便細(xì)菌培養(yǎng)提示了隨著MCDD造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠相對(duì)正常對(duì)照組小鼠逐漸出現(xiàn)了腸道菌群的紊亂。
　　 3、血清中ALT、AST水平隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，均數(shù)呈上升趨勢(shì)，但各時(shí)間節(jié)點(diǎn)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;TG的水平也隨時(shí)間變化呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，且各時(shí)間節(jié)點(diǎn)均與正常對(duì)照組呈顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4、血清TNF-a、IL-6、LPS水平造模組小鼠和對(duì)照組小鼠

8、在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)均表現(xiàn)出了差異。造模組小鼠血清TNF-a、LPS水平各時(shí)間節(jié)點(diǎn)均有顯著差異，且與造模時(shí)間呈明顯正相關(guān)關(guān)系。
　　 5、在P＜0.05的水平，TNF-a、IL-6、LPS、ALT均與病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系，其中TNF-a、IL-6、LPS相關(guān)關(guān)系極強(qiáng)(r=0.843，0.839，0.884)，ALT與病理評(píng)分關(guān)系中等(r=0.574);腸道細(xì)菌培養(yǎng)的B/E值與病理學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，關(guān)系比較強(qiáng)(r=-0.662)。

9、　　 第二部分:
　　 1、干預(yù)治療組（D組）小鼠一般情況恢復(fù)明顯優(yōu)于恢復(fù)飲食組（B組），B組死亡率達(dá)31.25％，其中三只死亡原因考慮為感染、兩只死亡原因不明。體重兩組均在3周內(nèi)恢復(fù)至正常，D組稍快，但兩組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、D組腸道菌群紊亂恢復(fù)明顯，第11天B/E值即與正常組無(wú)顯著差異(P=P=0.02)，且保持相對(duì)穩(wěn)定。僅通過(guò)飲食恢復(fù)，B組腸道菌群紊亂不能得到糾正。
　　 3、B組小鼠肝臟脂

10、肪性病變?nèi)匀幻黠@，且小葉內(nèi)炎癥明顯加重;D組小鼠脂肪性病變程度隨時(shí)間延長(zhǎng)有所下降，小葉內(nèi)炎癥幾乎未見(jiàn)加重。干預(yù)治療使D組病理表現(xiàn)有所改觀，與B組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.032)。
　　 4、相關(guān)性分析顯示代表腸道定植力的B/E值與病理評(píng)分在P=0.05水平上呈中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.526)，而乳酸桿菌與糞腸球菌均與病理評(píng)分在P=0.01水平上呈較強(qiáng)強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.648，-0.632）。提示了腸道菌群的異

11、常和NAFLD的病變程度之間的相關(guān)性。
　　 5、干預(yù)治療后D組小鼠TNF-a、IL-6、LPS水平均與干預(yù)治療前相比有所下降，而B(niǎo)組IL-6水平較前有所下降，TNF-a、LPS水平與干預(yù)前相比反而升高，干預(yù)對(duì)兩組TNF-a、IL-6、LPS水平的影響均表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.012，0.004，0、026)。而干預(yù)后D組小鼠表達(dá)水平與同周齡的正常對(duì)照組小鼠比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 6、干預(yù)治

12、療后B組小鼠ALT、AST、TG水平均與干預(yù)治療前相比略有升高，而D組小鼠均與干預(yù)前相比下降明顯，干預(yù)效果兩組表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.056,0.013,0、007)。
　　 [結(jié)論]:MCD飲食誘導(dǎo)2周可形成穩(wěn)定的NAFL動(dòng)物模型，該動(dòng)物模型出現(xiàn)顯著的血脂及炎性因子、內(nèi)毒素水平升高，升高程度與病變程度關(guān)系明顯，肝酶關(guān)系不明顯。NAFLD動(dòng)物模型存在明確腸道菌群紊亂，補(bǔ)充培菲康干預(yù)治療可有效糾正，僅恢復(fù)飲食治療不能改善