誘導型一氧化氮合酶基因轉染對雄激素非依賴型前列腺癌細胞的影響.pdf

1、前列腺癌是老年男性疾病，為西方國家最常見的腫瘤，死亡率高居第二位。隨著人們生活水平的提高，我國的前列腺癌發(fā)病率也顯著上升。手術治療、藥物治療、放射治療和生物治療是目前疾病治療的4大療法，雖然早期手術切除是根治前列腺癌的根本方法，但50％患者在確診時都已發(fā)生遠處轉移，常規(guī)的手術、內分泌及化學療法均難以明顯提高這些患者的生存期。尋找新的治療前列腺癌的方法迫在眉睫。一氧化氮以其雙重的生物學效應在腫瘤研究中得到了普遍的重視，腫瘤細胞產生的低濃度

2、NO促進腫瘤生長，而高濃度NO具有抗腫瘤作用。因此激發(fā)腫瘤細胞釋放大量的NO可能是一個抗腫瘤的新方法。多種途徑可以達到高濃度NO，例如在鼠黑色素瘤和人腎細胞癌細胞中轉染iNOS基因，達到了抑制腫瘤發(fā)展和轉移的效果。NOS基因轉移已在大量心血管疾病動物模型和某些人類組織上得到了證實，其表達能有效調節(jié)局部血管功能、抑制細胞增殖和遷移、且不干擾全身血液循環(huán)，明顯優(yōu)于直接補充外源NO。顯示了NOS基因治療心血管疾病的可能性和優(yōu)越性。因此內源性和

3、外源性的NOS將會是很有前途的治療劑或化療輔助劑，相對其他領域而言，一氧化氮在前列腺癌中生物學效應的研究還有一定的差距。目前國內外尚未見報道將iNOS應用于雄激素非依賴型前列腺癌。 我們在前期工作中，通過體外細胞培養(yǎng)，以SNP為外源性NO供體，研究外源性一氧化氮(NO)對前列腺癌細胞增值的影響，并對其作用機制進行了初步探討。我們認為外源性一氧化氮(NO)對前列腺癌ALAV-31細胞有雙重的生物效用：即低濃度的SNP可以促進其生長

4、，該機制可能是通過NO-cGMP途徑激活信使傳導，也可能在細胞信號傳導過程中調節(jié)細胞增殖相關基因的表達，從而促進了細胞的生長。而高濃度SNP所釋放的NO可以上調p21wafl/cipl基因，通過其蛋白的表達，使前列腺癌細胞的增殖周期受阻于G1期，抑制細胞的增殖，從而誘導前列腺癌細胞的凋亡。 多種方法可以合成分泌高濃度NO，文獻多采用NO供體如硝基擴血管藥物，作為模擬體內高濃度NO的研究手段，但存在耐藥性差、副反應大等缺陷。亦有方

5、案是通過活化淋巴細胞直接調節(jié)宿主的免疫應答，這一領域的治療主要是依賴IFN-α、β、γ和IL-2，由于特異性不強、毒性大等原因大多沒有廣泛應用。正因為采用藥物NO供體或細胞因子刺激產生NO有很多局限性，本研究試圖通過基因轉染的方法將外源性iNOS導入雄激素非依賴型前列腺癌細胞DU145中，上調細胞內iNOS基因的表達。在iNOS的作用下，細胞內NO的濃度升高，即建立了細胞性NO供體，能持續(xù)穩(wěn)定地釋放大量NO，從而干擾細胞的生長周期，誘導

6、細胞發(fā)生凋亡。前列腺在解剖位置上的易接近性以及對該病發(fā)病機制的認識，使得前列腺癌成為基因治療的研究熱點之一。目前國內外尚無報道將iNOS應用于前列腺癌，因此我們在前期研究的基礎上選擇研究本課題，我們希望將iNOS應用于前列腺癌基因治療能為臨床有效治療雄激素非依賴型前列腺癌( AIPC)提供一個新的思路。本課題由三部分組成。 第一章真核表達載體pReceiver-M29-iNOS(ORF)的擴增制備及鑒定 目的：將外源性i

7、NOS基因導入前列腺癌細胞內，首先需構建其載體。我們將iNOS基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)片段與質粒pReceiver-M29連接成重組DNA，擴增制備真核表達載體pReceiver-M29-iNOS(ORF)重組質粒，并進行酶切和測序鑒定，準備轉染人雄激素非依賴型前列腺癌細胞株DU145。 方法：先用限制性核酸內切酶EcoR I和Xho I酶切質粒pcDNA3.0-iNOS和pReceiver

8、-M29，瓊脂糖凝膠回收iNOS(ORF)基因片段和線性化質粒pReceiver-M29，純化回收產物并連接，將連接產物轉化制備好的轉化態(tài)大腸桿菌DH5α，搖菌擴增，堿裂解法抽取質粒；將提取質粒行酶切鑒定，并進行DNA測序分析，結果與GenBank公布的iNOS cDNA開放閱讀框序列比對，BLAST程序分析。 結果：擴增抽取的質粒用限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切得到預期的6.1kb的pReceiver-M29載體和

9、3.3kb的iNOS cDNA( ORF)片斷大小相當的兩個條帶；測序所得結果與GenBank公布的序列比對，BLAST程序分析提示符合度100％，閱讀框架正確。 結論：擴增得到了攜帶有iNOS cDNA開放閱讀框全長序列的真核表達載體pReceiver-M29-iNOS(ORF)質粒，閱讀框架正確。 第二章脂質體介導重組iNOS質粒的轉染和DU145細胞的培養(yǎng)篩選 目的：在第一階段，我們利用分子生物學手段構建了

10、iNOS的真核表達載體，在第二階段，我們將選用雄激素非依賴型前列腺癌細胞DU145細胞株作為研究和轉染的對象，獲得穩(wěn)定表達iNOS的雄激素非依賴型前列腺癌DU145細胞陽性克隆，進而用于進行細胞的后續(xù)研究。 方法：5％CO2，37℃條件下，DU145細胞培養(yǎng)于10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。按陽離子脂質體Lipofectamine2000說明操作，用重組pReceiver-M29-iNOS( ORF)質粒和空載體質粒pRece

11、iver-M29轉染DU145細胞，分組A為轉染pReceiver-M29-iNOS質粒組、B為轉染pReceiver-M29空載體組、C為對照Control組?？股谿418以400～700μg/ml篩選壓力篩選2周，第3周挑取細胞單克隆并在400μg/ml濃度的G418中繼續(xù)培養(yǎng)擴增。Trizol法抽提3組細胞的總RNA，RT-PCR以一步法逆轉錄制備cDNA及PCR反應，產物1％瓊脂糖凝膠電泳觀察攝片，片段回收并送測序。倒置、熒光

12、顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)。 結果：轉染10天后，對照組DU145細胞全部死亡，14天后轉染pReceiver-M29-iNOS質粒組、轉染pReceiver-M29空載體組始呈克隆狀生長，21天挑出單克隆繼續(xù)培養(yǎng)擴增。3組細胞抽提RNA，逆轉錄制備cDNA，PCR反應，p-actin為內參，瓊脂糖凝膠電泳，顯示轉染pReceiver-M29-1NOS質粒組出現與設計片段大小相當的條帶，而另兩組則無。熒光顯微鏡下觀察，轉染pRece

13、iver-M29- iNOS質粒組、轉染pReceiver-M29空載體組細胞可見綠色熒光。 結論：本部分成功建立了穩(wěn)定表達iNOS的DU145細胞陽性克隆。 第三章轉染外源性iNOS基因對雄激素非依賴型前列腺癌細胞DU145的影響 目的：在證實成功建立了穩(wěn)定表達iNOS的雄激素非依賴型前列腺癌DU145細胞陽性克隆并進行細胞培養(yǎng)擴增后，我們將探討轉染iNOS基因后，前列腺癌DU145細胞的生長和增殖、凋亡是否會

14、受到影響。 方法：5％CO2，37℃條件下，轉染pReceiver-M29-iNOS質粒組、轉染pReceiver-M29空載體組、對照Control組DU145細胞培養(yǎng)于10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)；分別用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡；細胞計數法、MTT法繪制細胞生長曲線；觀察使用NOS抑制劑對轉染細胞的影響。 結果：倒置顯微鏡下觀察，DU145細胞轉染iNOS后生長狀態(tài)變差，形態(tài)學惡

15、性表型減輕，流式細胞儀提示轉染iNOS組凋亡增加。生長實驗顯示轉染pReceiver-M29-iNOS質粒組細胞生長較兩對照組減慢(P<0.05)，NOS抑制劑可以加快其生長，但差異不具有顯著性(p<0.05)。 結論：轉染iNOS基因的DU145細胞能夠分泌高濃度的NO，轉染iNOS基因后，能夠誘導前列腺癌DU145細胞凋亡，抑制前列腺癌DU145細胞的生長，為雄激素非依賴型前列腺癌(androgenindependent p

16、rostate cancer，AIPC)的治療開辟一條新的途徑，為下一步的研究奠定了基礎。 抑制前列腺癌DU145細胞的生長。在腫瘤研究中最簡單的模型就是體外培養(yǎng)腫瘤細胞，現代培養(yǎng)技術已經能夠滿足需要。盡管細胞系的研究工作可以部分闡明腫瘤發(fā)生機制、生物學行為等某些腫瘤生物學性狀的重要信息，但其生長環(huán)境與體內不盡相同，且由于選擇性生長等因素，導致其研究結果具有一定的局限性。因此將iNOS應用于前列腺癌仍然有不少問題有待進一步探索，