難治性癲癇細(xì)胞模型中整合素alpha2表達(dá)的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　研究體外培養(yǎng)原代新生小鼠海馬神經(jīng)元的方法，觀察神經(jīng)元性狀及純度及通過無鎂細(xì)胞外液（Mg2+-free media）短暫作用后構(gòu)建的難治性癲癇細(xì)胞模型神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)變化，同時(shí)檢測(cè)對(duì)照組和模型組整合素alpha2(integrinα2)蛋白及mRNA的表達(dá)，探討體外培養(yǎng)難治性癲癇細(xì)胞模型中整合素α2的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化及意義，為進(jìn)一步研究難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　分離新生24h內(nèi)的小鼠海

2、馬神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)首日采用含10％血清培養(yǎng)液以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，之后改用添加B-27的適用于乳鼠神經(jīng)元的無血清培養(yǎng)液NEUROBASALTM-A Medium培養(yǎng)。利用倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元性狀。神經(jīng)微絲蛋白(Neurofilament protein，NF)鑒定神經(jīng)元。培養(yǎng)至第7天，將海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為兩組:
　　(1)正常對(duì)照組:維持培養(yǎng)液全量換液一次;
　　(2)難治性癲癇模型組:無鎂細(xì)胞外液（Mg2+-free

3、 media）培養(yǎng)3小時(shí)，再恢復(fù)維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)變化。應(yīng)用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-peroxidase method，S-P法）及半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測(cè)對(duì)照組及模型組12h組，24h組，48h組integ

4、rinα2蛋白及mRNA的表達(dá)量，利用圖像分析軟件分別計(jì)算各組免疫組化圖片平均光密度值(mean IOD)及PCR電泳條帶的相對(duì)灰度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)、采用該方案培養(yǎng)，大部分神經(jīng)元24h已貼壁，3d神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)初步形成，7-14d胞體豐滿，光暈佳，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接緊密分布均勻，為體外培養(yǎng)最佳狀態(tài)。經(jīng)NF鑒定，第7d神經(jīng)元純度為90％。
　　(2)、無鎂細(xì)胞外液構(gòu)建難治性癲癇細(xì)胞模型24h后，鄰近細(xì)胞

5、相互遷移，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)呈“網(wǎng)格樣”改變，48-72h，部分胞體相互融合。隨時(shí)間延長，融合圈擴(kuò)大，細(xì)胞老化或者死亡。
　　(3)、S-P法免疫染色后integrinα2蛋白表達(dá)主要位于軸突部，胞漿也有，蛋白相對(duì)表達(dá)量(mean IOD)如下:正常對(duì)照組0.033±0.005，模型組12h0.084±0.003，模型組24h0.076±0.018，模型組48h0.077±0.006。與正常對(duì)照組相比，模型組神經(jīng)元3個(gè)時(shí)間點(diǎn)integrin

6、α2蛋白表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)，12h即達(dá)到峰值，其后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)一直維持在較高水平。模型組各時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(4)、RT-PCR:各組均檢測(cè)到integrinα2 mRNA的表達(dá)，半定量RT-PCR結(jié)果顯示，正常對(duì)照組為0.316±0.039，模型組12h0.435±0.067，模型組24h0.453±0.046，模型組48h0.515±0.054。各時(shí)間點(diǎn)的模型組與正常對(duì)照組相比，int

7、egrinα2 mRNA表達(dá)均顯著提高(P＜0.05)，模型組各時(shí)間點(diǎn)之間差異無顯著性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)采用添加B-27的無血清培養(yǎng)液NEUROBASAL硼-A Medium培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)好，純度高。
　　(2)經(jīng)無鎂細(xì)胞外液處理3h構(gòu)建的新生小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞難治性癲癇細(xì)胞模型短期內(nèi)穩(wěn)定性良好，并引起了神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)學(xué)變化。
　　(3)體外培養(yǎng)新生小鼠海馬神經(jīng)元難