人胎肝細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)及重組HBV腺病毒的感染.pdf

1、背景： 乙肝病毒(HBV)感染仍然是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病，全球大約有20億人曾經(jīng)感染過(guò)乙肝病毒，其中超過(guò)3.5億人成為慢性感染者，每年可導(dǎo)致120萬(wàn)患者死亡，而且每年有32萬(wàn)患者死于HBV感染導(dǎo)致的肝癌。我國(guó)屬于肝炎高發(fā)區(qū)，現(xiàn)患乙型肝炎為2800萬(wàn)。 乙肝患者中25％～40％最終將死于肝硬化和肝癌，失代償性肝硬化的5年生存率約為15％，對(duì)于重癥肝病的治療，以保守治療為主，不能解決根本問(wèn)題，最終只能寄希望于原位

2、肝移植。 由于健康供體肝臟的嚴(yán)重短缺且費(fèi)用昂貴，僅有少數(shù)需要肝移植的患者可以接受原位移植治療。肝細(xì)胞移植技術(shù)為解決這一矛盾提供了新的思路和方法，同時(shí)也可能更適合我國(guó)大量患者的經(jīng)濟(jì)承受能力。肝細(xì)胞移植治療重癥肝病，具有創(chuàng)傷性小、費(fèi)用低廉、安全性高，免疫原性小，而且一個(gè)供體可以為多個(gè)受體提供細(xì)胞來(lái)源。經(jīng)過(guò)多年的基礎(chǔ)研究，肝細(xì)胞移植已經(jīng)初步應(yīng)用于臨床，目前已有多位患者接受了同種異體肝細(xì)胞移植或自體肝細(xì)胞移植(應(yīng)用或不應(yīng)用基因修飾)，證

3、實(shí)肝細(xì)胞移植對(duì)于治療肝臟遺傳性疾病及各種原因引起的肝衰竭有應(yīng)用價(jià)值。 目前用于臨床肝細(xì)胞移植的細(xì)胞主要來(lái)源包括：成體肝細(xì)胞、胎肝細(xì)胞。處于臨床前研究階段的細(xì)胞來(lái)源包括：異種肝細(xì)胞、肝前體/干細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞、基因修飾自體肝細(xì)胞移植等。 本文主要探討胎肝細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)及重組1.3拷貝HBV腺病毒感染人胎肝細(xì)胞。 目的： 1、為肝細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用及科研提供可靠的細(xì)胞來(lái)源。 2、建立長(zhǎng)期培養(yǎng)胎肝細(xì)胞

4、的平臺(tái)，為進(jìn)一步研究胎肝細(xì)胞做基礎(chǔ)。 3、建立重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞的體外模型，觀察了解HBV在胎肝細(xì)胞中的復(fù)制表達(dá)情況。 1、材料與方法： 1、胎肝細(xì)胞的分離1.1 胎肝來(lái)源于南方醫(yī)院婦產(chǎn)科流產(chǎn)胎兒。 1.2 采用改良兩步膠原酶灌注法，經(jīng)臍靜脈灌注胎肝分離胎肝細(xì)胞。 2、胎肝細(xì)胞的凍存：胎肝細(xì)胞的保存：凍存細(xì)胞密度為5-7×10<'6>/mL；凍存液由RPMI1640基培：人AB

5、血清：DMSO終濃度比例為6：3：1構(gòu)成；采用階段降溫法，即4℃、60分；-20℃、30分；-80℃、18小時(shí)；最后置于液氮中保存。 3、胎肝細(xì)胞的復(fù)蘇：采用常規(guī)快速?gòu)?fù)溫法，液氮中取出凍存管，迅速投入37～38℃水浴中，1分鐘快速融化。 4、長(zhǎng)期培養(yǎng)胎肝細(xì)胞方法的建立：胎肝細(xì)胞在用血清培養(yǎng)基貼壁生長(zhǎng)4小時(shí)后，Ham's F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，以去除培養(yǎng)液中胎牛血清、造血細(xì)胞及未貼壁的胎肝細(xì)胞。更換用Ham'sFl2基

6、礎(chǔ)培養(yǎng)基做母液，其中添加地塞米松、胰島素、胰高血糖素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)激素等配制成不含血清的條件培養(yǎng)基，每2天更換一次新鮮配制的條件培養(yǎng)基，5、重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞5.1 重組1.3拷貝HBV腺病毒：本室保存。 5.2 胎肝細(xì)胞：我科分離凍存的胎肝細(xì)胞，細(xì)胞活力為84％。 5.3重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞，孵育2小時(shí)后，洗滌細(xì)胞10次，細(xì)胞培養(yǎng)7天后收集上清，培養(yǎng)上清中HBsAg

7、、HBeAg的表達(dá)水平用雅培全自動(dòng)微粒子酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)；上清中HBV DNA載量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)；胎肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg及HBcAg的檢測(cè)用常規(guī)免疫組化法。結(jié)果： 1、采用兩步膠原酶灌注方法，在4℃條件下，在分離后的0、30、54、104、126小時(shí)，胎肝的活力分別為83％、78％、70％、65％、0％。應(yīng)用10％DMSO凍存胎肝細(xì)胞，1周、2周、2月后復(fù)蘇胎肝細(xì)胞，活力分別為84.17％、82％、84％。用倒

8、置相差生物顯微鏡對(duì)培養(yǎng)胎肝細(xì)胞進(jìn)行觀察顯示：胎肝細(xì)胞接種后2-3小時(shí)開(kāi)始貼壁、伸展，約6小時(shí)后完成貼壁過(guò)程；24小時(shí)后細(xì)胞由圓球形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則多邊形，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，細(xì)胞相互連接，部分肝細(xì)胞呈雙核；用不含血清的條件培養(yǎng)基在培養(yǎng)3天后肝細(xì)胞間相互接觸、滿布培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)的lO天、15天、30天及45天，倒置相差生物顯微鏡觀察仍清晰可見(jiàn)形態(tài)規(guī)則的單核細(xì)胞以及正在分裂的雙核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胎肝細(xì)胞高表達(dá)CD90及CD34表面標(biāo)記物，美

9、國(guó)雅培全自動(dòng)微粒子酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)到特異性AFP。 2、重組1.3拷貝HBV腺病毒感染胎肝細(xì)胞2小時(shí)后，洗滌lO遍后，培養(yǎng)7天后，上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA定量顯著增加，常規(guī)細(xì)胞免疫組化可檢測(cè)到胎肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg及HBcAg的表達(dá)。 結(jié)論： 1、經(jīng)臍靜脈插管兩步法分離胎肝細(xì)胞是一種有效簡(jiǎn)易的方法。 2、分離凍存的胎肝細(xì)胞可為臨床及科研提供穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。 3、采用條件培養(yǎng)基可