重組腺病毒Ad-HGF對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞抗HBV感染作用.pdf

1、目的:(1)體外培養(yǎng)JEGⅢ,確定Ad-HGF感染人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞(JEGⅢ)的最佳感染強(qiáng)度,檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞對(duì)HGF的表達(dá)水平,初步探討肝細(xì)胞生長因子(HGF)對(duì)JEGⅢ的調(diào)節(jié)作用,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。(2)Ad-HGF以最佳感染強(qiáng)度轉(zhuǎn)染JEGⅢ,建立乙型肝炎病毒(HBV)感染轉(zhuǎn)染Ad-HGF的JEGⅢ細(xì)胞模型,從形態(tài)學(xué)及定量兩方面探討HGF對(duì)HBV感染JEGⅢ的作用,為HBV宮內(nèi)感染的防治提供理論依據(jù)。
　　方法:第一部分

2、體外培養(yǎng)JEGⅢ,以攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)為實(shí)驗(yàn)組,攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒(Ad-GFP)為對(duì)照組,不同感染強(qiáng)度(MOI)(10,25,50,100,200,400,800,1600)轉(zhuǎn)染絨毛膜癌細(xì)胞系JEGⅢ,通過MTT法(檢測細(xì)胞損傷程度)篩選和確定最佳MOI(高轉(zhuǎn)染效率且對(duì)細(xì)胞低損傷),作為下一步攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最優(yōu)條件。以最佳的MOI轉(zhuǎn)染JEGⅢ后0,24,48,

3、72h后,收集細(xì)胞上清,用ELISA法檢測HGF蛋白的表達(dá)水平。第二部分基于前期研究,于5％ CO2,37℃的培養(yǎng)箱中,用含5%血清濃度的培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓,培養(yǎng)JEGⅢ細(xì)胞至50%鋪滿時(shí),Ad-HGF以最佳MOI(200pfu/cell)轉(zhuǎn)染JEGⅢ,48h后再加入HBV陽性血清(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科采自乙型肝炎志愿者,2×108HBV-DNA/L),使其終濃度為100DNA/細(xì)胞,共同孵育24h后,每隔12h,分別于感染HBV后24,

4、36,48,60,72h收集上清及細(xì)胞,將細(xì)胞用PBS洗一遍,800 r/min離心10min,棄去上清,再加入200μlPBS,置于-70℃冰箱中冷凍30分鐘,再放入37℃水浴中,反復(fù)凍融三次,1000 r/min離心10min,吸取上清,與所收集培養(yǎng)上清混勻,分別用HE、GIMSA染色及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化,熒光定量PCR檢測培養(yǎng)物中HBV-DNA。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:(1)以高

5、轉(zhuǎn)染效率且對(duì)細(xì)胞低損傷為標(biāo)準(zhǔn),確定最佳MOI為200pfu/cell。(2)Ad-HGF轉(zhuǎn)染JEGⅢ不同時(shí)間段后,ELISA法檢測HGF表達(dá)水平的結(jié)果顯示:Ad-HGF有效的導(dǎo)入了細(xì)胞,且HGF表達(dá)水平48h內(nèi)有時(shí)間依賴性,72h開始下降。(3)HE染色顯示Ⅱ組較Ⅰ組細(xì)胞有較明顯染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。Ⅲ組較空白對(duì)照組無明顯形態(tài)學(xué)改變。GIMSA染色與HE染色結(jié)果相近。(4)電鏡顯示:Ⅱ組較Ⅰ組細(xì)胞有較明

6、顯細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴模糊不清或消失,核周間隙增寬,線粒體擴(kuò)張,核膜模糊等現(xiàn)象,且Ⅱ組胞質(zhì)內(nèi)可見球形HBsAg顆粒,呈圓球形;Ⅳ組、空白對(duì)照組可見胞膜完整清晰,核仁大而明顯,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有豐富的脂滴、線粒體、高爾基器、糖原顆粒以及大量游離的核糖體,兩細(xì)胞膜接近處可見明顯的細(xì)胞連接,為橋粒連接。Ⅲ組較Ⅳ組無明顯變化。(5)分別于24h、36h、48h、60h、72h收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞內(nèi)的病毒,在轉(zhuǎn)染Ad-HGF的情況下,各時(shí)間點(diǎn)收集的標(biāo)本中檢測到的