mTORC1相關(guān)基因功能性多態(tài)位點與前列腺癌易感性及預(yù)后關(guān)系的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、前列腺癌是男性中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病具有顯著的地區(qū)及種族差異。中國前列腺癌的發(fā)病率也有逐年升高的趨勢。越來越多的證據(jù)表明，年齡、種族和家族史是目前公認的與前列腺癌發(fā)病相關(guān)的三大因素。前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能是機體遺傳易感性和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，而與此相關(guān)的遺傳變異則決定個體罹患前列腺癌的易感性。迄今為止，在世界上不同種族人群中的全基因組關(guān)聯(lián)性研究已經(jīng)揭示了超過30個易感位點與前列腺癌的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)。以候選基因為策略的前列腺癌

2、遺傳易感性的研究也取得了豐碩的成果。目前認為，前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后與遺傳物質(zhì)的多態(tài)性相關(guān)，而且這種相關(guān)性隨著高危易感基因數(shù)目的增加而明顯增高。研究還發(fā)現(xiàn)，盡管基因多態(tài)性與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，但這種影響的效應(yīng)度往往較低，且受環(huán)境因素的影響（包括內(nèi)、外環(huán)境）。目前尚無經(jīng)多中心驗證的、較為可靠的與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險及預(yù)后相關(guān)的遺傳多態(tài)位點。
　　PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路主要參與蛋白質(zhì)的合成。近年來，國內(nèi)外陸續(xù)有關(guān)該

3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因單核苷酸多態(tài)性與前列腺癌易感性關(guān)系的研究報道，但結(jié)果不盡一致。研究發(fā)現(xiàn)，該信號通路的活性主要與通路下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1)的生物學(xué)活性相關(guān)，體內(nèi)體外研究證實mTORC1的異常與癌癥的發(fā)生相關(guān)，并且是雷帕霉素作用的靶點。因此，有理由認為該復(fù)合物相關(guān)基因的多態(tài)性位點與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險可能相關(guān)。mTORC1由一系列直接或間

4、接作用于mTOR的關(guān)鍵分子共同組成，這些分子包括Raptor、mLST8、DEPTOR、PRAS40和mTOR。其中，Raptor與mLST8起正向調(diào)節(jié)mTOR的作用，而DEPTOR和PRAS40起負向調(diào)節(jié)mTOR的作用。本研究將以mTORC1相關(guān)基因為候選基因，結(jié)合mTOR分子mRNA及蛋白質(zhì)的表達及下游靶基因p70S6K和4EBP1的表達，在前列腺癌細胞株和前列腺癌組織標本上進行系統(tǒng)性的研究，有助于發(fā)現(xiàn)mTORC1在中國人群中與前列

5、腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)的遺傳易感位點，從而為揭示PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)基因多態(tài)性在前列腺發(fā)病中的作用提供可能的遺傳學(xué)證據(jù)，并為前列腺癌術(shù)后生化復(fù)發(fā)的預(yù)測提供可能的新的生物學(xué)標記。
　　第一部分 mTORC1相關(guān)基因遺傳多態(tài)性與前列腺癌易感性的關(guān)聯(lián)性研究
　　為了研究mTORC1相關(guān)基因的、具有潛在功能性的SNPs與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性，我們在中國華東地區(qū)漢族人群中選擇1015例前列腺癌病例和1093例健康男性，

6、開展以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對照關(guān)聯(lián)性研究，并采用Taqman探針方法對SNPs進行基因分型檢測，運用SAS9.1.3軟件包進行統(tǒng)計學(xué)描述及關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組以進展期前列腺癌為主，其中PSA大于20ng/ml的患者占54.4％，小于10ng/ml的患者占17.7％;而Gleason分級≤7(3+4)的患者占31.2％，≥7(3+4)的患者占59.7％;臨床分期Ⅰ+Ⅱ期患者占43.3％，Ⅲ+Ⅳ期患者占49.1％。本研究共檢測了mTOR

7、C1中5個基因的16個SNP位點，結(jié)果表明mTOR-rs2536[加性模型:1.34(1.08-1.66)，P=0.008;顯性模型:1.42(1.13-1.78)，P=0.003]，mTOR-rs1034528[加性模型:1.21(1.03-1.42)，P=0.019;顯性模型:1.29(1.07-1.55)，P=0.007]，mTOR-rs2295080[加性模型:0.80(0.69-0.94)，P=0.005;顯性模型:0.76(

8、0.64-0.92)，P=0.003]，及RPTOR-rs1062935[加性模型:1.14(1.01-1.29)，P=0.0341;顯性模型:1.28(1.06-1.56)，P=0.0127]與前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險顯著關(guān)聯(lián)。而亞組分析的結(jié)果也表明，mTORC1中mTOR-rs536，-134528，-2295080，以及RPTOR-rs1062935與前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，而患前列腺癌的風(fēng)險也隨著復(fù)合物中相關(guān)風(fēng)險基因數(shù)量的增加而明顯提

9、高。本研究中的基因內(nèi)多位點單倍體分析、基因內(nèi)多位點聯(lián)合效應(yīng)分析、以及基因間的聯(lián)合效應(yīng)分析中都發(fā)現(xiàn)與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性。在logistic顯性模型中我們發(fā)現(xiàn)隨著風(fēng)險基因型數(shù)目的增加，患前列腺癌的風(fēng)險也逐漸提高，這種等位基因劑量相關(guān)的效應(yīng)在mTOR多位點的聯(lián)合分析中顯示明顯的前列腺癌發(fā)病關(guān)聯(lián)性，在小于69歲，BMI體重指數(shù)小于24kg/m2，曾經(jīng)吸煙，Gleason評分≤7(3+4)，和臨床分期Ⅲ+Ⅳ的人群中尤其明顯。在進一步的交互作

10、用分析中，我們發(fā)現(xiàn)BMI和mTOR-rs2536(P=0.0031),BMI和AKT1S1-rs2290774(P=0.0496)，以及DEPTOR-rs4871827與RPTOR-rs1062935(P=0.0224)之間在前列腺癌發(fā)病方面均存在交互作用。
　　綜上所述，本研究運用較大的樣本量分析了mTORC1中SNPs與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)連性，并獲得了有價值的信息。但是本研究還是存在一些局限性。尚需要多中心、更大樣本量及設(shè)計

11、更加合理的研究來證實我們的研究結(jié)果。
　　第二部分 mTOR基因3，非編碼區(qū)陽性關(guān)聯(lián)位點的功能學(xué)研究
　　在第一部分的關(guān)聯(lián)性研究中，我們發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點mTOR-rs2536，-rs1034528，-rs2295080，和RPTOR-rs1062935與前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)。通過在線SNP分析平臺(http://snpinfo.niehs.nih.gov/sn pinfo/snpfu nc.htm)，我們進一步發(fā)現(xiàn)這些位點分別

12、位于相關(guān)基因的3'UTR，內(nèi)含子，基因旁區(qū)和內(nèi)含子區(qū)。鑒于3'UTR區(qū)是調(diào)節(jié)基因活性的關(guān)鍵區(qū)域，并和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，因此本部分對mTOR-rs2536的生物學(xué)意義進行了功能學(xué)研究，探尋其可能的生物學(xué)調(diào)控機制。在本研究中，我們構(gòu)建并克隆了含有mTOR3'UTR全序列的PGL3-Promoter-mTOR3，UTR質(zhì)粒，質(zhì)粒中分別導(dǎo)入mTOR-rs2536野生型及突變型堿基。雙熒光素報告基因法檢測結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-767

13、-3p類似物48小時后rs2536突變型的熒光相對比值要低于野生型，而該miRNA抑制劑的作用剛好相反，提示miRNA-767-3p對野生型堿基的抑制作用較明顯，結(jié)果與前期相關(guān)性分析結(jié)果一致，提示該位點可能通過與相應(yīng)miRNA結(jié)合進而影響mTOR的表達。在隨后的SNPexp在線分析平臺上做出的基因型-免疫表型相關(guān)性分析結(jié)果提示，mTOR-rs2536位點影響mTOR基因的表達水平，而且這種影響可能具有種族相關(guān)性。在本研究中，我們沒有發(fā)現(xiàn)

14、mTOR及其下游基因4EBP1和p70S6K的表達與mTOR-rs2536基因型之間的相關(guān)性;但我們發(fā)現(xiàn)，在癌組織中mTOR的表達水平(35.7％)要高于癌旁組織(28.8％);而4EBP1在癌組織及癌旁組織中的高表達率分別為32.1％和13.3％; p70S6K在癌組織及癌旁組織中的高表達率分別達到71.4％和39.4％。提示mTOR、4EBP1及p70S6K的活性與前列腺癌的發(fā)生或發(fā)展相關(guān)。
　　綜上所述，mTOR-rs253

15、6可能通過影響mTOR3'UTR與相應(yīng)miRNA的結(jié)合達到調(diào)控mTOR的作用。但目前的實驗證據(jù)還是比較輕微，只能作為一種參考，要證實mTOR3'UTR點突變對mTOR本身表達的實際影響，還需要找到本身帶有mTOR該SNP的細胞系進行mRNA和蛋白質(zhì)水平的研究，才具有確實的說服力。這是本論文的主要不足以及今后研究的方向。
　　第三部分 mTORC1相關(guān)基因遺傳多態(tài)位點對前列腺癌臨床結(jié)局的風(fēng)險評估
　　在mTORC1相關(guān)基因的遺

16、傳變異因素與前列腺癌預(yù)后的相關(guān)性研究中，我們選取423例有較完善臨床隨訪資料的前列腺腺泡腺癌患者，結(jié)合前期發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)的易感位點mTOR-rs2536、-rs1034528和-rs2295080以及RPTOR-rs1062935不同基因型進行前列腺癌根治術(shù)后的生存預(yù)后風(fēng)險評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.1的檢驗標準下，相對于mTOR-rs1062935TT基因型，攜帶CT/CC基因型的患者遠期生化復(fù)發(fā)的幾率要高（Plog-rank=0.067）;