牛鮮精、凍精抑制消減文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、哺乳動(dòng)物精液的冷凍保存在畜牧生產(chǎn)中起著重要作用。冷凍保存可以提高優(yōu)秀種公畜的利用效率，降低種公畜的數(shù)量，大幅度降低飼養(yǎng)成本；并且可以通過(guò)聯(lián)合育種，使優(yōu)秀種公畜的遺傳基礎(chǔ)迅速傳播，加快了品種培育的進(jìn)程；同時(shí)對(duì)稀有遺傳資源的保存也起到一定的作用。但是，目前精液的冷凍保存仍然存在受胎率低等問(wèn)題。其主要原因?yàn)榫釉诶鋬鰪?fù)蘇過(guò)程中受到了損傷，導(dǎo)致精子活力降低。很多學(xué)者從稀釋液、冷凍速率、劑型對(duì)精子頂體、膜結(jié)構(gòu)的影響等方面進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，但都

2、沒(méi)有取得理想的結(jié)果。精子冷凍損傷的機(jī)理成為進(jìn)一步提高冷凍保存效率的限制因素，即只有深刻揭示精子冷凍損傷的機(jī)理，才能為精子的冷凍保存提供理論基礎(chǔ)。RNA作為遺傳信息傳遞的中間載體，在精子發(fā)生、精子存活、精卵結(jié)合過(guò)程中都起著重要的作用。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組的系統(tǒng)研究，可初步確定精子在冷凍復(fù)蘇過(guò)程中基因的表達(dá)與否及豐度變化情況，為精子的冷凍損傷提供依據(jù)。但是，由于哺乳動(dòng)物的成熟精子作為精子發(fā)生的終末細(xì)胞，其形態(tài)高度濃縮，核外僅有一層薄薄的細(xì)胞膜，細(xì)胞

3、質(zhì)極少，RNA的含量極微，這就為我們研究提出了一個(gè)挑戰(zhàn)。 本研究針對(duì)精子結(jié)構(gòu)和RNA含量特點(diǎn)，對(duì)牛精子RNA提取進(jìn)行了摸索，找到一個(gè)針對(duì)牛精子RNA提取的方法-熱TRIzol法，并通過(guò)對(duì)持家基因GAPDH的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，證明了所制備RNA有較好的完整性，同時(shí)針對(duì)精子較低的RNA含量，采用SUPER SMART技術(shù)對(duì)所提取的鮮精、凍精轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了等比例擴(kuò)增，并采用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ對(duì)擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行了酶切，酶切后的cDNA

4、分成兩部分連接上不同的接頭，同未連接接頭的driver進(jìn)行連續(xù)兩輪的雜交，然后通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增后將擴(kuò)增子連接上pGEMTeasy載體并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌體內(nèi)。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，正庫(kù)得到1248個(gè)克隆，反庫(kù)得到672個(gè)克隆，隨機(jī)在正庫(kù)和反庫(kù)中各挑取300個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，將所得到的序列去載后，通過(guò)BLAST進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的序列都沒(méi)有找到同源基因。這可能由于牛的EST還很不完善所致，這樣可以通過(guò)對(duì)一些新的EST進(jìn)行研究，從而